| 研究課題/領域番号 |
26670700
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
中村 英二郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90293878)
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| 研究分担者 |
室伏 善照 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50448578)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | CRPC / Prostate cancer / Androgen |
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| 研究実績の概要 |
shRNA library screening (１次スクリーニング)
Cellecta社のPooled Lentiviral shRNA Libraries（http://www.cellecta.com/）をLibrary sourceとしてLentiviral Packaging plasmid を用いて Virus supernatantを作製し１細胞に対して1個のFragmentがIntegrationされる様にmultiplicity of infection（MOI）を調整した上でLNCaP細胞に感染させた。Infectionを行ったLNCaP細胞をPuromycinでselectionを行った後にCSFBS下での培養を行ったところ複数個のクローンが育っている(１次スクリーニング) 。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記の結果より、アンドロゲン非存在下で増殖している細胞はIntegrateされたshRNAにより去勢抵抗性を獲得したクローンであることが期待される。複数個のクローンが得られていることから、shRNA library screeningにおける１次スクリーニングが順調に経過していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
shRNAの発現によりアンドロゲン非依存性増殖能を獲得した上記のクローンをpick upし、in vitroにおいて増殖を行う。その後にgenomic DNAを抽出、IntegrateされたshRNA配列をPCR法により回収した後にIn-Fusion法にてlibraryのbackbone plasmidに再導入する。回収されたplasmidをLNCaP細胞に再度Infectionを行い、CSFBS下での細胞増殖能の再現性の確認を行う。２次スクリーニングを行った細胞の中で、アンドロゲン非依存性増殖能を示した細胞よりshRNA fragmentを回収、sequencingを行いblast searchにより標的mRNAの同定を行う。
shRNA library screeningで抽出された遺伝子に関してはGene Expression Omnibus (GEO) に寄託されたPrimary CaPとCRPCでの発現を比較し、後者での発現亢進を確認する。c-DNA library screeningから得られた分子に関しては遺伝子変異の有無を確認し、認められた場合はCOSMIC (Catalogue of Somatic Mutation in Cancer) にてCRPC組織での同様の変異が報告されているか確認を行う。変異が認められない場合は、GEOでのCRPC組織における発現亢進を確認する。
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