| 研究課題/領域番号 |
26670741
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
北尻 真一郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 特定病院助教 (00532970)
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| 研究分担者 |
山田 勇磨 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (60451431)
斎藤 潤 京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (90535486)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / 難聴 / アミノグリコシド / iPS細胞 / MITO-Porter |
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| 研究実績の概要 |
初年度の検討から、MITO-PorterのiPS細胞ミトコンドリアへの移行が10％と、HeLa細胞と比べ明らかに低率であることがわかった。そこで、本年度は、異なる組成のMITO-Porterを用い、３種類のwild-type iPS細胞（B2、B7、G4）と１種類の疾患iPS細胞について検討した。まず、外膜を構成するアルギニン８分子を２倍量にしたところ、高いカチオン密度により細胞内取り込みが増加し、ミトコンドリアへの移行も36％に増加した。そこでさらに組成変更を行った結果、ほぼ100％に近い取り込み効率を示す組成が見つかった。
一方、ゲンタマイシンの細胞内移行の別の策として、京大工学部・森泰生教授からヒトTRPA1プラスミドを供与頂いた。CAGプロモーターを用いることでiPS細胞に効率良く発現できたが、ゲンタマイシンの取り込み上昇にはつながらなかった。一般に、TRPA1チャネルが輸送体として機能するには、細胞負荷が必要であるため、「低温および薬剤負荷による酸化ストレス」条件下で検討した。結果、負荷による細胞死が顕著で、ゲンタマイシン傷害を評価することができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトiPS細胞から内耳有毛細胞への分化誘導は非常に難しいため、分化誘導遺伝子の導入等、あらたな手法が必要と思われる。それ以外については、予定通り遂行されている。
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| 今後の研究の推進方策 |
iPS細胞への取り込み効率の高い組成のMITO-Porterが得られたので、今年度は、ゲンタマイシンを封入し、wild-type iPS細胞と疾患iPS細胞とで比較検討を進める。
また計画書では、Wild-type iPS細胞と疾患iPS細胞の比較解析にHiCEP（High Coverage Expression Profiling）法を用いる予定であったが、情報量が中途半端かつピークのアノテーションに追加費用が派生することから、SILACによる質量分析を予定している。しかしながら、ヒトiPS細胞におけるSILACの検討報告はないため、ES細胞の報告を参考にしながら、基本培地の検討（必須アミノ酸量など）を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
iPS細胞への取り込み効率の高い組成のMITO-Porterが、予測していたよりも少々早めに得られたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
野生型iPS細胞と疾患iPS細胞の比較解析に、HiCEPに代えて用いる予定としたSILACの、基本培地等の検討に用いる。
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