| 研究課題/領域番号 |
26670782
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
後藤 薫 山形大学, 医学部, 教授 (30234975)
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| 研究分担者 |
秋元 亮 山形大学, 医学部, 助教 (40594677)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 低酸素 / HIF / 細胞内情報伝達系 / 塩化コバルト / 培養細胞 |
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| 研究実績の概要 |
心肺蘇生で自己心拍が再開した患者も、その後に生じる様々な臓器障害によって予後を悪化させることが2008年に心肺蘇生後症候群として報告された。心肺蘇生後の脳機能障害は、循環・呼吸停止による低酸素ストレスと心拍再開後の脳浮腫によって惹起されると考えられている。近年、心拍再開直後の低体温療法により、神経予後の改善が報告されているが、その明確な脳保護作用は明らかではない。HIFは低酸素状態での遺伝子発現の制御を行っており、エリスロポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アドレノモジュリン、エンドセリン、一酸化窒素合成酵素2(NOS2)などの制御を介して、低酸素に対する応答を制御する。ジアシルグリセロールキナーゼ（DGK）は二次伝達物質ジアシルグリセロール（DG）をリン酸化してホスファチジン酸（PA）に変換する酵素でありファミリーを形成することが明らかになっているが、その中でゼータ型DGK（DGKζ）がHIFの機能発現制御に関与することが報告されている。本研究では、低酸素状態におけるDGKζとHIF関連蛋白の機能解析を第一の課題として実験を行った。まず低酸素条件の設定として、培養細胞を用い実験系による、低酸素（１％酸素）および低酸素模倣刺激（塩化コバルト、DMOG）、グルコース利用阻害（2-デオキシグルコース）によるHIF誘導条件の基本設定を行った。その結果、低酸素ストレス刺激に先立って、無グルコール培養液によるプレ培養が有効なこと、またHIF分解酵素阻害剤であるDMOG刺激が最も有効なHIF誘導刺激であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで、低酸素におけるさまざまな実験系が報告されてきたが、HIFの分解系は厳密に制御されていることが明らかになってきた。今年度の実験により、培養細胞を用いた低酸素条件をいくつか検討することにより、酸素利用とグルコース利用が密接に関連していることを明らかにした。これまで、DGKζは海馬ニューロンにおいて、一過性の低酸素・低グルコース負荷（OGD）を受けると、核からしだいに細胞質に移行する現象を見出し報告してきたが、非ニューロン系の培養細胞では、DGKζの核細胞質移行現象は起こり難く、ニューロンとは異なるメカニズムが作動していることが強く示唆されることが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は低体温による影響を考慮するために、30℃の培養条件を設定し、HIFの分解系、およびDGKζによる制御機構を追求したい。さらに動物レベルでの条件設定を検討する。具体的には、HIFの分解はユビキチンプロテアソームにより制御されていることが明らかになっているので、HIFのE3リガーゼであるVHL蛋白の発現変化も検討すべきではないかと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ウエスタンブロットによるHIFの検出に大きなばらつきが認められ再実験を繰り返しており、低温培養実験への移行に遅れが生じているため。HIFの検出は低酸素ストレスの重要な指標なので、検出感度を高めるために様々な方法を検討した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
いくつかのメーカーのHIF抗体を比較検討し、より感度の高い抗体を選択する。またHIF以外の指標もいくつか検討する予定である。
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