研究課題
平成２６年度はTg マウス作製のためのトランスジェニックベクターの構築を行った。プロモーターはマウスの乳腺組織への遺伝子導入が可能なマウス乳がんウイルスのMMTV (mouse mammary tumor virus)遺伝子プロモーターを入手した。MMTV 遺伝子プロモーターの下流に、まずSV40改良型のイントロン配列と骨転移遺伝子としてCadherin-11を組み込んだ。骨転移がん細胞の確認と定量的計測のために改変型GFP遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を融合させたffLuc遺伝子を入手し、2A配列とともにCadherin11の3'領域にサブクローニングした。Cadherin11遺伝子とffLuc遺伝子を同じMMTVプロモーター化制御下で同時発現を可能にする2Aペプチド配列を挿入している。トランスジェニックベクター構築の前に、CMVプロモーターに組み込んだCadherin11-2A-ffLuc遺伝子を乳がん細胞にトランスフェクションし、Cadherin11およびffLucのたんぱく質が正常に発現することを確認した。トランスジェニックベクターの構築後は、シークエンス解析により遺伝子配列に変異がないこと、また方向性が正しいことを確認した。トランスジェニックベクターを含むプラスミドをエンドトキシンフリーの環境下で生成した後、Spe1およびSal1で直鎖化した。現在、直鎖化したトランスジェニックベクターの受精卵へのマイクロインジェクションし仮親マウスへ移植するための準備を進めているところである。
3: やや遅れている
平成２６年度では、Cadherin11遺伝子、MMTV遺伝子プロモーターおよびffLuc遺伝子の入手と2A配列を組み込んだトランスジェニックベクターの構築を終えることができた。また、DNA塩基配列の確認およびたんぱく質発現の行い、問題なく機能することを確認していることから、トランスジェニックベクターの構築は順調に進んでいると判断してよい。しかし、受精卵へのマイクロインジェクションを進めてはいるが、当初の予定であった、仮親マウスへの移植と産仔の獲得を終えていないためやや遅れていると評価した。平成２７年度は早い段階でマイクロインジェクションを行う予定であり、今後は研究が順調に進展していく予定である。
平成２７年度はトランスジェニックマウスの選別と維持をまず行う。受精卵に直鎖化したトランスジェニックベクターをマイクロインジェクションし仮親マウスへ移植する。その後、産仔からゲノムDNA を精製し、ffLuc遺伝子を認識するプライマーを用いてゲノムPCR を行い、ファウンダーマウスを選別する。野生型マウスとの交配を行いTgマウスラインを確立する。次のステップとして、本研究により作出されたトランスジェニックマウスと、自然発症乳がんモデルマウスを交配することによりダブルトランスジェニックマウスを作製する。本研究で確立する乳がん自然発症モデルマウスとしてはMMTV-neuマウスを用いる予定である。得られたマウスの骨転移を蛍光実態顕微鏡および発光イメージングシステムにより観察する。骨転移モデルマウスが樹立された後はマウスが示す骨転移の生物学的特性の解析を行う。臨床的には骨転移は骨吸収が亢進する溶骨型、骨形成が促進する骨形成型、そして骨吸収と骨形成が混在する混合型が報告されている。そこで、バイオイメージングによる解析に加えて骨転移が確認された部位の病理組織切片を作製し、骨転移の様式を解析する。さらにTRAP染色により破骨細胞の検出を行う。乳がんは肺、副腎および脳へも転移することから、骨組織以外の臓器に関しても転移の有無を検討する予定である。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 3件)
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