研究課題
本研究で用いたP0-Cre/CAG-CAT-EGFPダブルトランスジェニックマウスは、胚発生時期の神経堤細胞特異的に活性化するミエリンプロテインゼロ(P0)遺伝子のプロモーターによりCreリコンビナーゼが発現し、神経堤細胞がその後分化してもGFPが産生され、各組織に存在する神経堤由来細胞はGFP陽性細胞として検出できる。毛包全体の組織学的な解析からGFP陽性細胞は、特に毛乳頭とバルジ領域に存在することが認められた。バルジ領域は幹細胞が存在し、将来上皮のケラチノサイトや毛乳頭へ細胞を供給することが知られている。ダブルトランスジェニックマウスより採取した毛包細胞をFGF含有の幹細胞培地で培養すると、培養経過に伴いGFP陽性細胞の割合が高くなり、培養開始2週後には、全細胞数のおよそ95%を陽性細胞が占めた。それらの細胞をフローサイトメーターで解析すると、幾つかの間葉系幹細胞マーカーの発現が高いことから、未分化性を保持したまま増殖したと考えられる。GFP陽性細胞をBMP含有の骨芽細胞誘導培地で培養すると、アルカリフォスファターゼ(ALP)活性が上昇した。ALP活性は、BMPの濃度に依存して上昇した。アリザリンレッド染色、Von Kossa染色も陽性を示し、GFP陽性の毛包細胞は骨芽細胞様細胞へと誘導された。さらにInsulin含有の分化誘導培地によってOil Red O染色陽性の脂肪細胞が出現した。これらの結果、成体マウスの毛包に存在する神経堤由来細胞は、未分化な状態で多分化能を有する細胞集団であることが明らかになった。
3: やや遅れている
P0-Cre/CAG-CAT-EGFPダブルトランスジェニックマウスを用いて、神経堤由来細胞の毛包内の細胞分布、細胞表面マーカーの解析、細胞増殖を促す最適条件ならびに骨芽細胞分化誘導など多分化能についての解析が計画どおり達成された。一方、網羅的遺伝子発現解析から、毛包神経堤由来細胞特異的に発現する遺伝子を選抜する計画について未だ候補遺伝子を特定しておらず、発現抑制実験の実施に至ってないことから、総合的な研究全体の達成度区分を「やや遅れている」と評価した。
P0-Cre/CAG-CAT-EGFPダブルトランスジェニックマウスの毛包から神経堤由来細胞を純化・培養して、骨芽細胞培養シートを骨欠損部に移植する。あるいは、コラーゲンを主体としたスキャホールドに神経堤由来細胞を包埋後に、欠損部へ移植する。骨欠損モデルの他に、骨延長あるいは歯周病モデル動物を用いて、神経堤由来細胞が持つ骨組織誘導・骨再生能について解析する。解析法として、組織形態学的評価と高解像度mCTから評価する。なお、効率的に骨を誘導できるスキャホールドの組成について検討を加える。
毛包神経堤由来細胞特異的に発現する遺伝子の特定が遅れたため、発現抑制実験あるいは細胞表面マーカーによる細胞純化実験が実施できず、平成26年度研究費を繰り越した。
毛包神経堤由来細胞特異的に発現する遺伝子の検索に関わる費用以外には、骨欠損、骨延長あるいは歯周病モデル動物を用いた、骨組織誘導・骨再生能の評価・解析にあてる。
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