細菌性バイオフィルムの固着を阻害する新規化合物の作製と感染制御効果の検索

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26670816
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
• 研究分担者: 小田 真隆 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00412403) ; 土門 久哲 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00594350)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 脂質化合物

研究実績の概要

申請者らは，癌の免疫療法薬の開発を目指し，免疫活性化作用を示すジフテリア菌の細胞表層糖脂質TDCMに着目し，その誘導体合成と構造活性相関研究を展開してきた．そして，近年，アレルギー性ショックや重篤な炎症性症状を引き起こすことなしに，免疫力を活性化して，癌の転移・増殖を効果的に抑制する糖脂質をジフテリア菌成分から同定し，「Vizantin」と命名した．Vizantinの生物活性を検索したところ，固着緑膿菌に対して殺菌作用を有することが示唆された．そこで，Vizantinの細菌性バイオフィルム形成阻害・平滑面への菌体付着に対する効果について，う蝕原因菌であるミュータンス菌，および院内感染症の起因細菌MRSAを用いて検討し，バイオフィルム阻害効果を有する臨床応用可能なVizantin誘導体の作製を図ることにした．
(1)　Vizantinの動物への投与も考慮し，溶解剤を選択した．Vizantinを含む免疫賦活効果を示す化合物（約50種類）は，水に不溶性であるため，エマルジョン溶液，あるいは5％血清アルブミン溶液に溶解した．(2)　Vizantinの溶解性を向上させるため，解析ソフト（ケムドローウルトラ，MOE）を用いてin silicoスクリーニングを行った．今回は、Vizantinのトレハロース部位の構造を変化させ，溶解性が高いと考えられる約20種類の化合物を有機合成した．(3)　ミュータンス菌やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成に対する各種化合物の効果について，クスタルバイオレット，Syto9，ローダミンDなどの染色剤を用いて解析した．歯面を模倣するため，カチオンチャージした96ウェルプレート，および人工唾液でペリクルを形成したハイドロキシパタイト樹脂を用いて候補化合物を探索した．バイオフィルムの画像は、Keyence社製BIOREVOを用いて解析した．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

二ヶ年計画の研究初年度は，これまでVizantinの欠点であった溶解性の悪さ故の薬物調製の難しさを克服するため，in silico構造予測スクリーニング法により，溶解性の向上したVizantinの構造をコンピューター上で網羅的に探索検証し，候補化合物の合成を行った．これまでの検証の結果，Vizantinの脂肪側鎖部位の構造は，活性発現にとても重要なため，トレハロース部位の水酸基に着目した誘導体の作製を行った．その後，Vizantin，および新たに合成した誘導体をミュータンス菌やMRSAのバイオフィルム形成実験に供し，バイオフィルム形成抑制作用，あるいはバイオフィルムの平滑面付着抑制作用を有する化合物の同定を行った．計画二年目は，実験用小動物を用いたin vivoモデルに対する候補化合物の効果について評価する計画となっており，概ね順調に進捗している．

今後の研究の推進方策

実験動物は，生後15日目に強制離乳させたSprague Dawley系ラットの雄を使用する．生後15日目から前年度に選出した化合物をイソフルランで麻酔したラットの歯面に毎日塗布する．さらにミュータンス菌液を1日1回，ラットの口腔内に直接摂取する．二週間後、歯面へのプラーク形成状態についてRegoratiとHolzの方法で算出する．【寺尾・小田】
(2)　候補化合物のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の感染拡大に対する効果を解析するため，Chamber modelを用いて解析する．ステンレスコルクをマウスの背部へ埋入後，候補化合物を1週間に2回，経口，あるいは静脈内投与する．2週間後，コルク内部へ発光遺伝子(pGEN5)を有したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を注入し，IVIS50を用いて黄色ブドウ球菌の感染局部における挙動を経時的に観察する．共試菌感染後も候補化合物の投与を続ける．【寺尾・土門】

次年度使用額が生じた理由

脂質化合物の合成に際し，可溶化率の高い化合物のスクリーニングに時間を要した．その結果として，合成する化合物の購入試薬の遅れが生じた．

次年度使用額の使用計画

既に，計画に要する化合物のスクリーニングは終了しており，計画を１ヶ月程度ずらして大量合成に必要な試薬を順次購入する計画である．

研究成果

• [雑誌論文] Clostridium perfringens alpha-toxin induces GM1a clustering and TrkA phosphorylation in the host cell membrane. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takagishi, T., Oda, M., Kabura, M., Kurosawa, M., Tominaga, K., Urano, S., Ueda, Y.,Kobayashi, K., Kobayashi, T., Sakurai, J., Terao, Y., and Nagahama, M
  • 雑誌名: PLoS one 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endoplasmic reticulum stress response and bone loss in experimental periodontitis in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamada, H., Nakajima, T., Domon, H., Honda, T., and Yamazaki, K.
  • 雑誌名: J. Periodontal Res. 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Residual structure of Streptococcus mutans biofilm following complete disinfection favors secondary bacterial adhesion and biofilm re-development. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohsumi, T., Takenaka, S., Wakamatsu, R., Sakaue, Y., Narisawa, N., Senpuku, H., Ohshima, H., Terao, Y., and Okiji, T.:
  • 雑誌名: PLoS one 巻: 10 ページ: e0116647
  • 査読あり
• [雑誌論文] Vizantin inhibits endotoxin-mediated immune responses via the Toll-like receptor 4/MD-2 complex. (2014)
  • 著者名/発表者名: Oda, M., Yamamoto, H., Shibutani, M., Nakano, M., Yabiku, K., Tarui, T., Kameyama, N., Shirakawa, D., Obayashi, S., Watanabe, N., Nakase, H., Suenaga, M., Matsunaga, Y., Nagahama, M., Takahashi, H., Imagawa, H., Kurosawa, M., Terao, Y., Nishizawa, M., and Sakurai, J.
  • 雑誌名: J. Immunol. 巻: 193 ページ: 4507-4514,
  • 査読あり
• [雑誌論文] Age-related alterations in gene expression of gingival fibroblasts stimulated with Porphyromonas gingivalis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Domon, H., Nakajima, T., Tabeta, K., and Yamazaki, K.
  • 雑誌名: J. Periodontal Res. 巻: 49 ページ: 536-543
  • 査読あり
• [学会発表] Streptococcus pyogenes CAMP factorのRAW264.7細胞に対する病原性解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 黒澤美絵，小田真隆，土門久哲，寺尾豊
  • 学会等名: 第88回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 岐阜，長良川国際会議場
  • 年月日: 2015-03-25 – 2015-03-28
• [学会発表] Streptococcus mutansバイオフィルムに対する植物由来抽出物の検索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂上雄樹，土門久哲，小田真隆，興地隆史，寺尾豊
  • 学会等名: 第51回日本細菌学会中部支部総会
  • 発表場所: 金沢，北陸大学薬学部
  • 年月日: 2014-10-17 – 2014-10-18
• [学会発表] 慢性炎症性疾患におけるT L R シグナル抑制因子の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 黒澤美絵，小田真隆，土門久哲，寺尾 豊
  • 学会等名: 第51回日本細菌学会中部支部総会
  • 発表場所: 金沢，北陸大学薬学部
  • 年月日: 2014-10-17 – 2014-10-18
• [学会発表] 多機能性糖脂質の自然免疫活性化メカニズムの解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小田真隆，山本博文，黒澤美絵，土門久哲，寺尾 豊
  • 学会等名: 第51回日本細菌学会中部支部総会
  • 発表場所: 金沢，北陸大学薬学部
  • 年月日: 2014-10-17 – 2014-10-18
• [学会発表] イメージングと細菌学研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 寺尾 豊
  • 学会等名: 第67回 日本細菌学会中国・四国支部総会
  • 発表場所: 徳島，徳島文理大学薬学部
  • 年月日: 2014-10-04
  • 招待講演
• [学会発表] A群レンサ球菌CAMPファクターのマクロファージに対する病原性解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小田真隆，黒澤美絵，土門久哲，寺尾豊
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡，福岡国際会議場
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] 歯周炎におけるTLR シグナル抑制因子の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 土門久哲，小田真隆，寺尾豊
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡，福岡国際会議場
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] 合成糖脂質のStreptococcus mutansバイオフィルムに対する作用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 黒澤美絵，小田真隆，土門久哲，寺尾豊
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡，福岡国際会議場
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] Streptococcus mutansに対する植物由来抽出物の殺菌ならびに抗バイオフィルム効果の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂上雄樹，土門久哲，小田真隆，興地隆史，寺尾豊
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡，福岡国際会議場
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [図書] 日本歯科評論：ナノスケールの研究を歯科医学に， (2014)
  • 著者名/発表者名: 寺尾 豊
  • 総ページ数: 181
  • 出版者: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [備考] 研究者の作成HP
  • URL: http://www.dent.niigata-u.ac.jp/microbio/microbio.html