研究課題/領域番号 |
26670890
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研究機関 | 東京歯科大学 |
研究代表者 |
新谷 誠康 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (90273698)
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研究分担者 |
櫻井 敦朗 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90431759)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | アメロブラスチン / 進化医学 / 分子進化 / 両生類 |
研究実績の概要 |
平成26年度に作製したカエルアメロブラスチン抗体を用いて、カエルの歯の各形成段階におけるアメロブラスチンタンパク質の発現の変遷を調べた。実験動物を麻酔下にて屠殺し、歯の存在する上顎骨を摘出し、固定した。通法に従い、摘出した上顎骨を脱灰し、包埋後に薄切標本を作製し、免疫組織化学染色を行った。免疫染色はstreptavidin-biotin complex(SABC)法によって行った。切片通法に従い処理した後、抗カエルアメロブラスチン抗体(一次抗体)と反応させた後、二次抗体であるビオチン標識ブタ抗ウサギIgG 抗体反応させ、内因性ペルオキダーゼ活性を不活化させた後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンービオチン複合体反応させて免疫染色を行った。免疫反の発色は0.02% 3,3’-ジアミノベンチジン・4 塩酸(DAB)を用いた。抗体はアメロブラスチンタンパク質の異なった領域を認識する2種類を作製して使用したが、それぞれの抗体が反応する領域は異なり、アメロブラスチンタンパク質は両生類においてもクリベージ後に異なった機能を持つペプチドに分かれる可能性が示唆された。また、In situ ハイブリダイゼーション実験の予備実験も順次行った。すなわち、カエル上顎骨よりRNA を抽出し、カエルAMBN 遺伝子配列をもとにRT-PCR 用のプライマーを作製し、RT-PCR による遺伝子断片を増幅した。増幅した遺伝子断片をプラスミドベクターにクローニングし、プラスミドの大量精製後、制限酵素で切断し鋳型DNA を作り、この鋳型を使ってin vitro 転写を行い、RNA プローブを調製した。Proteinase K による前処理後、通法に従ってハイブリダイゼーションを行い、非特異的結合除去した後、プローブの可視化した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は平成26年度に作製・評価した抗カエルアメロブラスチン抗体を用いて、形成中のカエルの歯の免疫組織化学的染色を行う予定であrったが、これらは順調に進行しており、さらにIn situ ハイブリダイゼーション実験の予備実験も順次行えた。
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今後の研究の推進方策 |
In situ ハイブリダイゼーション実験を本格的に行うとともに、免疫組織化学染色の結果と併せて結果の分析を行う予定である。
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次年度使用額が生じた理由 |
年度末に入荷予定であった物品の入荷が遅れたため。
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次年度使用額の使用計画 |
年度空けに速やかに使用する予定。
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