研究課題
本申請で対象とする、高等真核生物を特徴づけるRNA転写後修飾の化学構造形成に関わる生合成遺伝子の探索を行い、特定した遺伝子の1つNSUN3に関する論文を公開し、関連の学会発表を行った。遺伝子探索とその成果について(1) NSUN3の作用で生じた5-メチルシチジン修飾に対する酸化酵素を発見した(以下MTHO1と称する)。 MTHO1の遺伝子ノックアウト(KO)細胞をCRISPR/Cas9技術で作成し、5-ホルミルシチジン修飾が欠損し、5-メチルシチジンのまま修飾が進行しないことを見出し、またin vitroでの酸化反応を再構成した。KO細胞の各種解析により、ミトコンドリア機能の低下を示した。MTHO1に関する論文投稿を進めている。 (2) 昨年度までに同定した糖転移型修飾酵素に関し、クローニングにより組み換えタンパクを取得し、in vitroでの修飾再構成に成功した。酵素のキネティクス解析を行い、並行して、作成したKO細胞のストレス環境下での生育阻害の可能性を探索している。
2: おおむね順調に進展している
概要の(1)について、推定した多段階生合成反応の第2段階以降にあたる酸化酵素の特定に成功したことにより、修飾構造の試験管内での完全再構成に成功し、細胞の性質の解析まで実施可能になった。(2)について修飾再構成を達成したことから遺伝子産物が酵素活性を担う組み換えタンパクを用いた生化学的解析が可能となり、またKO細胞の表現型の探索を複数のストレス環境刺激下で比較していくスキームを構築しつつある。
引き続き未同定の遺伝子については生化学的実験による酵素活性の追跡や比較ゲノムによる絞り込みを活用した候補遺伝子絞り込みの2方面から進める。遺伝子を特定したものについては、酵素としての性質を組換えタンパクやその変異体を用いた生化学的解析により明らかにする実験を進める。培養細胞でのストレス刺激下における増殖能変化の評価など生理機能の探索を進める。培養細胞を用いたin vivo翻訳特性の変化を追跡するレポーター系の構築や遺伝子発現プロファイル変動の網羅的解析を進める。
実験系に既存の環境を十分に活用できていることに加え、同定した遺伝子由来の組み換えタンパクの取得により生化学的解析と、ゲノム編集で取得したノックアウト細胞の継続的培養による表現型探索などを集約的に行うことで、リソース消費の効率化が成された。
継続的な実験を行うが、遺伝子探索やそれに伴う関連の生化学実験・細胞実験の規模を適切な範囲内で拡大していく計画である。また、これまで予備的検討にとどまっている、修飾欠損tRNAのdecoding能を評価する新たな翻訳レポーター実験系の構築、細胞全体の翻訳プロファイルの変動を網羅的に捉える大規模シーケンス解析のためのサンプル調製など、本研究で得られた知見から将来に展開できる新たな実験系を実施する。
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