| 研究課題/領域番号 |
26702036
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
成川 礼 静岡大学, 理学部, 講師 (30456181)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | シアノバクテリオクロム / オプトジェネティクス / 遠赤色光 / cAMP |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、シアノバクテリアAcaryochloris marina由来のシアノバクテリオクロムAM1_1557g2、AM1_C0023g2を用いて、網羅的変異導入解析により、長波長吸収ビリベルジン（BV）を結合する構造基盤解明を目指した。AnPixJg2というシアノバクテリオクロムはBVを結合できないのに対し、A. marina由来の上記の二つのシアノバクテリオクロムはBVを高効率で結合することで、遠赤色光の吸収が可能となっている。そこで、AnPixJg2の立体構造を基に、BV結合型にのみ高度に保存されているアミノ酸を抽出し、それらの変異導入解析を進めた。その結果、8アミノ酸がBV結合に重要であり、これら8つのアミノ酸を導入するだけで、本来BVを結合することができなかったAnPixJg2にBV結合能を付与することに成功した。また、哺乳類培養細胞・HeLa細胞にAM1_1557g2とAM1_C0023g2を導入し、PCBを細胞に添加することで、赤色光照射により、培養細胞から近赤外蛍光を観察することに成功した（Fushimi et al. Front. Microbiol., 2016）。さらに、AnPixJg2とアデニル酸シクラーゼの融合タンパク質を作製し、緑色光下よりも赤色光下の方が、約3倍アデニル酸シクラーゼ活性が誘導されるキメラタンパク質の創出に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの研究で、AM1_1557g2というタンパク質がBVを高効率で結合し、遠赤色光を吸収することができることが分かったが、これに加えて、AM1_C0023g2も同様にBVを結合することができることが明らかとなった。両者のBVに対する結合効率を比較したところ、AM1_C0023g2の方が、結合効率が高いことが明らかとなった。さらに、AM1_C0023g2を土台として変異導入解析を行ったところ、BVの結合能が上昇し、ほぼ100%の結合能を有するタンパク質の取得に成功した。さらに、AM1_1557g2、AM1_C0023g2とBVを結合しないAnPixJg2とを比較することで、BVを結合するのに重要な8つのアミノ酸を同定することに成功した。これら8つのアミノ酸を導入するだけで、AnPixJg2はBV結合能を獲得した。部位特異的導入解析により、蛍光量子収率が上昇する変異体取得を試みたが、現在までに量子収率の高くなった変異体は得られていない。しかし、BVよりは短波長であるが赤色光を吸収するフィコシアノビリン（PCB）を結合したAM1_C0023g2の量子収率が3.0%と比較的高いため、これを哺乳類培養細胞・HeLa細胞に導入し、細胞にPCBを添加したところ、近赤外蛍光の検出に成功した（Fushimi et al. 2016 Front. Microbiol.）。また、PCBを結合した赤色光と緑色光で変換する光受容ドメインとアデニル酸シクラーゼドメインとを融合したキメラタンパク質を作出することで、赤色光下で緑色光下よりも3倍程度活性が誘導される系の開発に成功した。
以上のことから、蛍光量子収率の高い遠赤色光吸収型タンパク質の取得はまだ出来ていないが、in vivoの解析等、想定以上に進んでいる研究もあるため、全体としては当初の予定通り順調に研究が進んだと自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は最終年度であるため、これまでの研究成果を論文としてまとめつつ、蛍光量子収率の高いタンパク質の取得を最優先課題として研究を進める。ランダムに変異を導入したタンパク質について、コロニーレベルの蛍光を指標としてスクリーニングを行い、強い蛍光の変異タンパク質の取得を目指す。二番目の優先課題としては、BVを結合して遠赤色光に応答するアデニル酸シクラーゼの開発である。前年度から多くのキメラタンパク質を作製しているが、未だに高性能のスイッチタンパク質は得られていない。前年度の、8つのアミノ酸を導入するだけでBV結合能を付与することに成功したタンパク質を土台として、キメラタンパク質の開発を進める。論文としては、赤色光誘導型アデニル酸シクラーゼ、8つのアミノ酸導入によるBV結合能付加の二つについて論文化を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の終わりに、蛍光の量子収率が高い変異体を取得するために、スクリーニングの系を立ち上げ始めた。スクリーニングをより効率良く進めるためには、多検体の細胞を同時に破砕し解析する系が必要であることが分かった。そのための機器を選定したところ、ちょうど100万円超であることが判明した。そこで、その分の金額を次年度に繰り越し、次年度早々にその機器を購入することで、最終年度の最優先課題を効率良く進められると考えた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に繰り越した分は、上述した細胞破砕機器の額に相当する。その費用分以外は、予定通りである。研究員の雇用と試薬・小額機器類に適切に使用することで、効率良く研究を進める。また、最終年度であるため、論文執筆にも注力する。論文掲載料等に係る費用も随時使用する予定である。
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