| 研究課題/領域番号 |
26710002
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
大槻 元 京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (60723278)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | クローン細胞 / 遺伝子改変マウス / 大脳皮質 / 一次視覚野 / 生体下Ca2+イメージング / 3次元位置機能解析 / 機能発達 / 4細胞同時パッチクランプ記録 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、大脳皮質一次視覚野において由来する幹細胞を同一にするクローン神経細胞群で機能発達が起こる仕組みを解明する。その際、二光子顕微鏡による生体内でのCa2+神経活動記録と脳スライス標本下の神経細胞群からの多電極パッチクランプにより、クローン細胞間のシナプス伝達と可塑性誘導、およびそれに対する投射を調べ、機能構造の発達過程を明らかにする。前年度（平成26年度）は、視覚野神経細胞の方位選択性機能の3次元位置に基づいた数値解析を行い、幼若期と成体での機能類似性の違いを明らかにした。その結果、遺伝子改変マウス（TFC.09 x Ai14系統）脳内のクローン細胞群では、開眼直後（P14-P24）の幼若期での機能の類似度が成体よりも高く、さらに個々のクローン細胞に対して、自身を中心として直径30μmの円柱内に存在する他のクローン細胞の方位選択性が、特に似ている（最適方位角が近い）ことが分かった。また、幼若期のクローン細胞群は水平方向へ選択性を持つ集団が多く見つかった。このことから、クローン細胞レベルでの機能類似性は、一次視覚野全体での方位選択性の水平方向と垂直方向への強いバイアスを形成し、発達に従ってバイアスが弱まることが示唆された（Ohtsuki et al., 2015, 日本神経科学大会）（Ohtsuki, 2015, 京都大学学内シンポジウム）。開眼後のクローン細胞群の視覚機能変化機序を解明するために、現在、脳切片下で複数のクローン細胞から同時記録を行って、シナプス結合の結合確率、伝達強度、放出確率を調べている。幼若期脳内で、５８の神経細胞結合を調べたところ、確かにクローン細胞同士では、非クローン細胞とのそれと比べて、結合確率が高かった。しかしながら、細い円柱内での高い結合確率は見つからなかった。今後、外側膝状体からの入力が共有されるか明らかにし、成体マウスと比較する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
生体下2光子Ca2+イメージング実験とその解析については、３次元的位置と方位選択性の類似性との解析を数値解析によって、開眼直後の幼若期と成体動物とで比較した。また、クローン細胞群を標識した遺伝子改変動物の視覚野神経細胞からの多細胞同時記録（最大４個同時記録）を行い、幼若期の神経細胞の結合を調べた。次に、成体マウスと比較し（研究目的 仮説２の検証）、外側膝状体からの入力が共有されるか否か明らかにする（研究目的 仮説３の検証）。
しかしながら、昨年度から、私は九州大学大学院医学研究院から京都大学白眉センターに異動し、京都大学大学院理学研究科へと異動した。それに伴って、遺伝子改変動物を移送したが、当研究科の動物飼育室はSPF化（無病原菌化）動物しか搬入できない。そのSPF化の際に外部委託したが、納入後、遺伝子改変動物の導入遺伝子が喪失されたことがわかり、再度、輸送措置を講じることになった。このために、研究に遅れと出費が起こった。現在までに２０頭ほどの遺伝子改変動物（TFC.09 x Ai14系統）の大脳皮質の神経細胞群からのペーアド、トリプル、クアドロプル記録（２-４個同時記録）に成功している。さらに外側膝状体細胞の軸索刺激実験に、本年度は挑戦する。本年度は、安定してクローン細胞を標識したマウスが供給できる体制を整えているので、極力、本研究推進に専念し、学術論文としての公表につなげたい。
本研究計画と、直接の関連はないが、研究費によって導入した電気生理学機器によって、脳内の神経興奮性に関連する実験データを得ることができ、一部、学術論文とした（Grasselli G/ Ohtsuki G/ Hansel C, Cell Rep. 2016）。また、京都大学白眉プロジェクトと連携し、未公表ながら神経免疫-神経興奮性可塑性に関連する実験データも得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
生体下2光子Ca2+イメージング実験と数値解析による、開眼直後の幼若期と成体動物とで比較に関して、学術論文にまとめることを予定していたが、まだ公表には至っていない。クローン細胞群を標識した遺伝子改変動物の視覚野神経細胞からの多細胞同時電気生理学記録による、幼若期の神経細胞の結合に関して、今後、成体マウスと比較し（研究目的 仮説２の検証）、外側膝状体からの入力が共有されるか否か明らかにし（研究目的 仮説３の検証）、データを付け加えたうえで学術論文にまとめたいと考えている。現在得られているデータからは、『幼若期脳内では視覚野内での神経細胞同士の結合よりも、他の外部からの入力が共有されているのではないか』、また、『狭い半径の円柱内に存在するクローン細胞群に外側膝状体からの入力が共有されているのではないか』、と推察される。この点に焦点を絞って、生理学実験を進めたい。
二光子顕微鏡を用いた残りの実験は、上の研究完了ののち、取り組みたい。その際、生体下観察は共同研究によって行う。また、クローン細胞間でのシナプス可塑性誘導の検証にも取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度未使用額が126,972円となり、次年度使用額に計上することとなった点について、私自身が前年度未使用分を執行が可能である点を失念していたため、あるいは、誤って認識していたためである。交付決定額（H27）の範囲内で、研究遂行しようと配慮してしまった。誤りで執行しなかった点について、非常に反省している。次年度は、遺漏の無いよう心掛ける。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度予算として、電気刺激装置の購入、または国内外の学会発表予算に充てる。
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