| 研究課題/領域番号 |
26710011
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山中 総一郎 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80711845)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ヘテロクロマチン / piRNA / エピジェネティクス / トランスポゾン / 遺伝子発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、特定ゲノム領域に存在するタンパク質やRNAを同定するための手法の開発を主眼に置いて研究を進めた。申請書においてはPIWI/piRNAによって発現抑制を受けるプラスミドを細胞から回収することを当初計画していた。計画通り、PIWI/piRNAによって発現抑制を受けるレポータープラスミドを構築することが出来たが、そのプラスミドを細胞から回収することに現段階で成功していない。よって、別の系の構築を開始した。CRISPR/Cas9は任意の遺伝子座に欠失・挿入を人為的に引き起こすことに広く使用されているツールである。Cas9はDNA切断活性を有しており、CRISPR RNAは任意の遺伝子座へとCas9を連れて行くガイド因子として働く。そこで申請者は、このCRISPR/Cas9をベースにして、特定ゲノム領域の濃縮を目指した。具体的には、ゲノムの切断活性を持つアミノ酸に変異を導入したCas9と、興味のある遺伝子座で設計したgRNAを細胞に導入し、その後Cas9を細胞から濃縮した。まずは、転写が活発に行われている遺伝子座を標的にこの手法を適用した。その結果、免疫沈降産物の中にヌクレオソームが銀染色で確認出来る程度にまで系を改善した。さらに転写やスプライシングに関与する核内タンパク質群の濃縮も見られた。次にこの手法をトランスポゾン領域で行った。申請者の使用した培養細胞ではトランスポゾンはヘテロクロマチン化を受けている。ヘテロクロマチン領域は高次構造をとり、タンパク質が近づきにくいゲノム領域である。そこでトランスポゾン領域がCas9によるゲノム切断を受けるかを確認したところ、興味深いことにCas9はこのゲノム領域を切断できることが明らかとなった。現在、トランスポゾン領域を上記のシステムで免疫沈降することで、この領域に存在するタンパク質群を網羅的に同定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「研究実績の概要」にもあるように、当初のプラスミドをベースにした系の構築は、現在までに達成できていない。そこで、当該年度ではCRISPR/Cas9をそれに換わる系として構築してきた。プラスミドをベースにした系の長所は、レポータープラスミドに導入するトランスポゾン配列を容易に改変できるところにある。具体的には、「全長のトランスポゾンとプロモーター活性を失ったトランスポゾンでは、それらの遺伝子座上に存在するタンパク質群にどのような違いがあるか」といったことを簡便に検証できる。ただ、あくまでプラスミドは外部から導入したものであり、そのプラスミドが生体内で起こっていることと同じ挙動を示す保証はない。それに対してCRISPR/Cas9を用いた系では、注目した遺伝子座の精細な改変を行うには時間や手間がかかる一方で、この手法の最大のメリットは細胞内にもともと存在する染色体を検証出来る点にある。さらに、ゲノム上にはプロモーター活性を失ったトランスポゾンも存在することから、上に挙げたような実験も検証可能である。以上の理由から、当初予定していた系よりも様々な点ですぐれた系が現在構築されつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR/Cas9を用いた特定ゲノム領域の濃縮において、免疫沈降産物には多くのバックグラウンドが存在する。申請者はgRNAの有無という点に注目し、gRNAの存在下で特異的に免疫沈降される因子群をピックアップしてきた。ただ、この実験系においてgRNAを導入していない細胞から免疫沈降してきた画分にも相当数のタンパク質が存在することを確認している。これらは、免疫沈降に用いたビーズや抗体、さらにCas9タンパク質に「非特異的に」結合しているものである。申請者の注目するタンパク質群はCas9タンパク質が結合する染色体領域に存在するものである。言い換えると、それらの因子群の濃縮はDNaseに感受性となるはずである。そこで、精製の最終ステップである「ビーズからの免疫沈降産物の溶出」を現行の界面活性剤ではなくDNaseを用いて行う。この処理により、ビーズや抗体、Cas9タンパク質に非特異的に結合する因子群が溶出されないと期待され、免疫沈降産物内のバックグラウンドの大幅な低減につながると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において、プラスミドを用いた「特定ゲノム領域の濃縮システム」の構築を目指したがそれが成功せず、CRISPR/Cas9システムをベースにした別の系を立ち上げた。当初、プラスミドを用いた系で得られた因子に関して抗体作製、ChIP解析、次世代シーケンサーを用いた解析を行うことを予定していたためそれらに費やす研究費が残額となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
27年度においては、CRISPR/Cas9を用いた系ですでに複数の因子が単離されている。それらに関して抗体作製、ChIP解析、次世代シーケンサーを用いた解析を行うため、前年度から繰り越した研究費をこれに使用する。
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