ヒストン修飾新規リーダータンパク質による転写機構解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26710013
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 神吉 康晴 東京大学, アイソトープ総合センター, 助教 (00534869)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 血管新生 / エピジェネティクス / ヒストン修飾

研究実績の概要

本研究は、申請者が見出した新たなヒストン修飾変化に対する生物学的意義を解明し、その修飾が形成される分子機構、更に新規ヒストンリーダータンパクの同定を行う。申請者はこれまでに、血管内皮細胞を用いて次世代シークエンサーを用いた網羅解析から、血管内皮細胞活性化に寄与する転写因子、エピゲノム修飾を報告してきた（Kanki Y et al 2011 MCB, EMBO Jなど）。そこで、本申請では、内皮細胞にとって最も重要な活性化シグナルであるVEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor)に着目し、その下流の分子カスケード解析から、より副作用の少ない新たなエピゲノム創薬の標的を探索することを目的としている。
平成26年度は、HUVECs（ヒト臍帯静脈内皮細胞）にVEGF刺激を行い、0分、15分、60分後のRNA-seq、ChIP-seq、FAIRE-seqのデータを取得した。ChIP-seqには、活性化マークであるH3K4me3、H3K27me3、H3K27ac、H3K9me3の抗体を用いた。その結果、RNA-seq解析から見出されている早期誘導転写因子群に特異的なヒストン修飾が存在することを見出した。
次に、これら特徴的なヒストン修飾を媒介する酵素の探索を行った。その結果、H3K4のメチル化を修飾するMLL3に結合する新規タンパクを質を同定した。このタンパク質の機能を阻害すると、血管新生は顕著に阻害された。更に、マウスを用いて腫瘍移植実験を行い、このタンパク質の発現を阻害するとコントロール群と比較して腫瘍の増大は抑制された。
本研究により、平成26年度は特にH3K4修飾に着目することで、血管新生に関与する新しいエピジェネティクス修飾因子を同定することが出来た。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初の予定では、平成26年度は、早期誘導遺伝子特異的なヒストン修飾に対して、H3K4me3、H3K27me3それぞれの意義を検討するものであった。H3k4me3に関しては、これまでの予備実験からMLL3の関与が示唆されていたが、本研究ではそのMLL3に加えて更にMLL3と相互作用するタンパク質を同定している。このタンパク質をノックダウンするとH3K4me3の修飾レベルの低下、遺伝子の発現低下の両者が認められることから、血管内皮のVEGF刺激下の早期誘導遺伝子に関するH3k4me3の役割解析は予想以上に進行した。
もう一つの修飾であるH3K27me3に関しては、これまでの文献からポリコーム複合体が関与していることが示唆されていた。本研究ではポリコーム複合体の1（PRC1）と複合体2（PRC2）どちらもその機能を阻害すると、血管新生阻害が引き起こされることを確認しており、こちらも当初の予想より進行している。

今後の研究の推進方策

平成26年度の研究成果により、血管内皮細胞が活性化される際にはヒストン修飾酵素が重要であることが明らかとなった。ヒストン修飾酵素は血管内皮細胞のみならず、発生や分化、生活習慣病や癌などの病態にも深く関与している。将来の創薬を考える際に、正常細胞の機能は阻害せずに病的な血管新生のみを阻害するメカニズムを解明しなければならない。
そこで、ヒストン修飾酵素が血管内皮細胞内でVEGF刺激下でのみ形成する複合体に着目している。これまでの研究で、VEGF刺激した際に早期誘導される転写因子は20個程度であることが分かっている。これらの遺伝子座でのみ形成されるタンパク質、RNA、DNAの複合体が血管新生の鍵であると考えられるため、平成27年度は、EGR3やEGR2に着目して遺伝子座特異的な複合体解析を行っていく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Genome-wide approaches reveal functional vascular endothelial growth factor (VEGF)-inducible nuclear factor of activated T cells (NFAT) c1 binding to angiogenesis-related genes in the endothelium. (2014)
  • 著者名/発表者名: Suehiro J, Kanki Y, Makihara C, Schadler K, Miura M, Manabe Y, Aburatani H, Kodama T, Minami T.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 17 ページ: 29044-59
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.555235.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct evidence for pitavastatin induced chromatin structure change in the KLF4 gene in endothelial cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maejima T, Inoue T, Kanki Y,,, Wada Y
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 9 ページ: e96005
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0096005.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cross-enhancement of ANGPTL4 transcription by HIF1 alpha and PPAR beta/delta is the result of the conformational proximity of two response elements. (2014)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Kohro T, Tanaka T, Kanki Y, Li G, Poh HM, Mimura I, Kobayashi M, Taguchi A, Maejima T, Suehiro J, Sugiyama A, Kaneki K, Aruga H, Dong S, Stevens JF, Yamamoto S, Tsutsumi S, Fujita T, Ruan X, Aburatani H, Nangaku M, Ruan Y, Kodama T, Wada Y.
  • 雑誌名: Genome Biol. 巻: 15 ページ: R63
  • DOI: 10.1186/gb-2014-15-4-r63.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Three Dimensional Chromatin Architecture Correlates with Two Opposite Transcription Factors, which contributes the Cell Specificity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Teppei Shimamura, Shuichi Tsutsumi, Hiroyuki Aburatani, Youichiro Wada
  • 学会等名: The 4D Nucleome 2014
  • 発表場所: 安芸グランドホテル、広島県、日本
  • 年月日: 2014-12-17 – 2014-12-20
• [学会発表] Three Dimensional Chromatin Architecture Correlates with Two Opposite Transcription Factors, which contributes the Cell Specificity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Teppei Shimamura, Shuichi Tsutsumi, Hiroyuki Aburatani, Youichiro Wada
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市、日本
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] Three Dimensional Chromatin Architecture Correlates with Two Opposite Transcription Factors, which contributes the Cell Specificity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Teppei Shimamura, Shuichi Tsutsumi, Hiroyuki Aburatani, Youichiro Wada
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会議場、京都市、日本
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Three Dimensional Chromatin Architecture Correlates with Two Opposite Transcription Factors, which contributes to the Cell Specificity (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki
  • 学会等名: 11th EMBL Conference Transcription and Chromatin
  • 発表場所: EMBL, Heidelberg, Germany
  • 年月日: 2014-08-23 – 2014-08-26
• [学会発表] GENETIC AND EPIGENETIC LANDSCAPE OF ENDOTHELIAL CELLS DIFFERENTITATION REVEAL THE TRANSCRIPTIONAL FACTORS NETWORK (2014)
  • 著者名/発表者名: Kanki, Yasuharu, Matsunaga, Taichi, Ryo, Nakaki, Yamamizu, Kohei, Shimamura, Teppei, Miyano, Satoru, Aburatani, Hiroyuki, Kodama, Tatsuhiko, Wada, Youichiro, Yamashita, Jun, Minami, Takashi
  • 学会等名: International Society For Stem Cell Research the 12th annual meeting
  • 発表場所: The Convention Center, Vancouver, Canada
  • 年月日: 2014-06-18 – 2014-06-21
• [学会発表] Transcription Factor GATA2 is indispensable for the Differentiation and Maintenance of Vascular Endothelial Cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Taichi Matsunaga, Hiroyuki Aburatani, Youichiro Wada, Tatsuhiko Kodama, Jun Yamashita, Takashi Minami
  • 学会等名: the 18th International Vascular Biology Meeting
  • 発表場所: みやこメッセ、京都市、日本
  • 年月日: 2014-04-14 – 2014-04-17