|
難培養性細菌（難培養細菌・未培養細菌）と呼ばれる細菌は、培養が不可能もしくは非常に困難な細菌である。難培養性細菌は決して珍しいものではなく、近年のメタゲノム解析などの台頭により、環境中の微生物の99%以上は培養できないことが明らかとなり、これにより新たな微生物像が浮き彫りとなった。これらの難培養性細菌は、その全ゲノム配列を決めることで多くの知見が得られる一方で、遺伝子のノックアウトや過剰発現ができないという技術的な欠陥のため、その遺伝子の機能についての確実な証明はほとんどされていないのが現状である。
本研究は、近年開発された「全ゲノム操作技術」を応用することで、難培養細菌の培養および遺伝子操作系の開発を目指し、難培養細菌の持つ多様な機能を解明することを目的とする。これには、全ゲノム操作、全ゲノムクローニング、全ゲノム移植などが可能でかつ培養可能な細菌であるマイコプラズマ(Mycoplasma capricolum)を用いる。
本年度は、酵母内におけるゲノム編集を用いた手法を用いた研究を行った。酵母におけるゲノム編集は極めて有用な手法であり、これまで検討していたRecombinase-mediated cassette exchange (RMCE) 法や、Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC) 法などと共に、非常に有効な手法であった。加えて、酵母においてクローニングしたゲノムのインサートを引き続き検証した。酵母細胞からintactな染色体を抽出し、ここから酵母が本来持っている染色体を除外し、導入したゲノム（YAC）のみが残るように処理を行い、そこから抽出したゲノムDNAを用いて、次世代シーケンスにより配列を確認した。その結果、クローニングした配列は元のゲノム配列とほぼ同じであり、ほとんど変異の無い状態でクローニングができていることが分かった。
|
