| 研究課題/領域番号 |
26711010
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
玉田 洋介 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (50579290)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 補償光学 / ライブイメージング / 顕微鏡 / 幹細胞 / 植物 |
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| 研究実績の概要 |
幹細胞化におけるクロマチン修飾の機能を理解するため、申請者らはコケ植物ヒメツリガネゴケを用いて幹細胞化過程におけるクロマチン修飾の4D（3D＋時間）ライブイメージングを行ってきた。しかし、細胞内構造体を介した光の屈折により像が劣化するため、既存の顕微鏡系では必要な分解能が得られないことが明らかとなった。そこで、光の屈折を補正して高分解能観察を行う天文技術である補償光学を応用した新規顕微鏡系を確立し、幹細胞化過程におけるクロマチン修飾の精細な4Dライブイメージングを行うことが本研究の目的である。光学研究者である服部雅之博士、天文学研究者である早野裕博士ら、複数の研究協力者の協力のもと、平成２６年度は以下の研究を行った。
１、4Dイメージングに必要な断層像を得るためには共焦点系が必要である。確立済みの補償光学全視野蛍光顕微鏡に共焦点系を組み込むための研究を、ハードウェア、ソフトウェアの両面から進めている。
２、補償光学を動作させるためには観察対象の近傍に明るい参照光源が不可欠である。これまでは葉緑体の自家蛍光を参照光源として用いていたが、光学系を工夫し、自家蛍光よりもはるかに弱い蛍光タンパク質の蛍光を参照光源として補償光学を動作させることに成功した。また、細胞質基質に広く存在するペルオキシソームを蛍光タンパク質で標識したヒメツリガネゴケを作出した。上記研究によって、細胞内の広い場所で補償光学を動作させるための環境が整った。
３、光を屈折させて顕微鏡像を劣化させる細胞内構造体が葉緑体であることを、蛍光ビーズを用いた4Dイメージング、数値計算、およびシミュレーションによって明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画では、本年度は主に補償光学全視野蛍光顕微鏡に共焦点系を組み込み、精細な断層像を得ることを目的としていた（上記１）。こちらは、計画調書に記載の共同研究体制に、新しいメンバーを加えて、ハードウェア、ソフトウェアの両面から研究が進行中である。それに加えて、主に平成２７年度に予定していた、蛍光タンパク質を用いた補償光学系の動作に本年度すでに成功し（上記２）、当初の計画以上の進展があった。また、イメージングに最も影響を与えるのが葉緑体であることを複数の視点から解明した（上記３）。この情報は、補償光学系の設計に有益な情報となる。以上のことから、本年度の達成度は総合的に「おおむね順調に進展している」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
補償光学共焦点蛍光顕微鏡については、引き続きハードウェア、ソフトウェアの両面から共同研究を進める。また、平成２６年度よりもさらに低発現の蛍光タンパク質の微弱な蛍光でも補償光学が動作させられるように、補償光学系をさらに改良する。具体的には、補償光学顕微鏡を用いたライブイメージングから得られた情報をもとに、リレーレンズ、ミラー、フィルターなど光学素子の位置および種類の調節を行い、より光障害が小さく、より高精細に補正が行える光学系の構成を解明する。こうした補償光学顕微鏡の構成と、補償光学顕微鏡を用いて得られたクロマチン修飾の精細なライブイメージングの結果をまとめて、論文の執筆・投稿を行う。
葉緑体がライブイメージングに与える影響の解析については、蛍光ビーズ像の解析、数値計算、シミュレーションを進め、それらの結果をまとめて論文の執筆と投稿を行う。
また、クロマチン修飾検出プローブの改良・新規作出を行う。これまでに、申請者が開発したクロマチン修飾検出プローブを用いて幹細胞化過程の4Dライブイメージングに成功しているものの、その多くは細胞の生育を阻害する性質があり、しばしば幹細胞化まで阻害されてしまう。そのため、用いるタンパク質の一部を欠失させることで、クロマチン修飾への結合能は維持されているが、幹細胞化は阻害しない新規プローブを作出する。また、これまでに検出プローブを作出していないクロマチン修飾についても、新しくクロマチン修飾検出プローブを作出する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度に計上した研究費のうち、主に「人件費・謝金」と「その他」の予算に次年度使用額が生じた。「人件費・謝金」は主に研究員もしくは技術支援員の雇用のために計上していたが、予算規模に応じた適切な人材が見つからなかったため、適切な人材が見つかるまで使用を延期することが、本研究の目標達成のために最も適切であると判断した。適切な人材が見つかり次第、人件費として使用する。また、「その他」は主に論文出版費用として計上したものである。計画よりも論文の完成が遅れているが、平成２７年度中に論文の投稿・出版を行う予定であり、その際の論文出版費用として使用する。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度は、本研究計画に必要な顕微鏡系に適した補償光学制御ソフトウェアを研究開発するにあたり、その基盤、もしくは一部として用いることが可能な、既存の補償光学制御ソフトウェアないしはそのディベロップメントキットの購入を予定している。現在、複数社のソフトウェアを検討しており、価格と性能をあわせて考慮する。また、消耗品としては、光学用部品、分子生物学実験用試薬、植物育成・採取用器具などを購入する。旅費は、国内・海外の研究協力者との共同研究のための旅費や、国内・国際学会に参加するための費用として用いる。人件費は、光学、工学、分子生物学、植物学に素養のある研究員、技術支援員を雇用するために用いる。その他は、主に論文出版費用として用いる。
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| 備考 |
アウトリーチ活動など
1. オーガナイザー：早野 裕、大屋 真、亀井 保博、服部 雅之、玉田 洋介ら、シンポジウム「すばる望遠鏡から顕微鏡へ：次世代三次元補償光学系を用いた生体イメージング・光操作に向けて」、国立天文台（東京都三鷹市）、2014年8月20、21日
2. 研究・施設紹介：玉田 洋介ら、愛知県立豊田西高等学校の高校生約30名に研究紹介、基礎生物学研究所（愛知県岡崎市）、2014年8月7日
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