| 研究課題/領域番号 |
26711018
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
岡本 昌憲 鳥取大学, 乾燥地研究センター, 助教 (50455333)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 植物ホルモン / アブシジン酸 / ケミカルバイオロジー / 環境応答 / ストレス適応 |
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| 研究実績の概要 |
アブシジン酸(ABA)の生理作用は様々な植物種間に多数存在するPYR/PYLと呼ばれる受容体を介して、時空間的に様々な下流因子を介して引き起こされる。ストレス応答に関わるABAシグナル伝達因子の多くが明らかにされたが、ABAがどのように植物の成長を制御しているか明らかになっていない。本研究では、特定のABA受容体だけに結合し、特異的な組織に作用する新奇バイオプローブを用いて、植物の生長制御に関わるABAのシグナル伝達機構の解明を目的としている。
新奇ABAアゴニスト(115C07化合物)はこれまで報告されてきたピラバクチンやキナバクチンとは異なり、種子発芽阻害や植物におけるABA応答を引き起こさず、胚軸の成長阻害のみを引き起こす。115C07による胚軸成長阻害は、代表的ABA非感受性変異株abi1では引き起こされないことから、新奇ABAアゴニストは主要ABAシグナル経路に作用していると考えられる。115C07化合物は現段階で、ABA受容体のPYL11とPYL12の両者に作用していると考えられるが、PYL11とPYL12の遺伝子は同一染色体上で2000塩基の非常に接近した場所に位置しているため、二重変異体の作成が困難である。そこで人工miRNA法を用いて、PYL11とPYL12の共通配列を認識して、両者受容体の機能を低下したトランスジェニックを作成し、T2種子を得た。
ABA受容体13種類のうち、PYL7とPYL12だけが、機能性タンパク質が得られていなかった。選択的ABA受容体のアゴニストを完全に特徴づけるためには、13種類のABA受容体すべてに対して解析しなければならない。PYL7とYPL12の塩基配列を大腸菌発現系用にコドン改変したところ、可溶化したタンパクが得られた。
115C07の標的ABA受容体以降の下流シグナル伝達を明らかにするために、115C07化合物に対して非感受性変異株を単離した。2つの変異株で染色体1番の上腕の3M付近にマーカーがマップされ、既存のABAシグナル因子はこの領域に存在しないことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度では、PYL11とPYL12の遺伝子発現を同時に抑制する人工miRNA形質転換株の作成を計画した。PYL11とPYL12遺伝子の共通配列領域を標的にしたmiRNAコンストラクト二種類を構築した。これを用いて、二種類のトランスジェニックを作成し、T2種子を得た。115C07の標的受容体は、in vitroでの酵素活性実験では、PYL11とPYL12であるが、115C07化合物が植物体内で代謝され、代謝型115C07が異なるABA受容体を標的にしている可能性も考えられる。そこで、PYL11とPYL12遺伝子以外の変異株の整備をすすめ、様々な組み合わせのpyl多重変異株を作成した。PYL11とPYL12に性質の近い、PYL受容体に関しては、優先的に進めており、pyl4pyl8pyl9, pyl6pyl8pyl9などの多重変異体を作成した。
選択的なABAアゴニストを定義するためには、全てのABA受容体に対して生化学的解析を行う必要性がある。これまで、PYL7とPYL12に関しては、機能的なタンパク質が得られていなかった。大腸菌発現用に塩基配列をコドン最適化することで、可溶画分に十分のタンパク質が得られた。しかしながら、ABA受容体の標的タンパク質であるPP2CのHAB1の酵素活性をABA依存的に阻害する機能を保持していなかった。HAB1以外のPP2Cを選択的に標的にしている可能性もあるために、他の9種のPP2Cをクローニングして、発現ベクターに導入した。
また、115C07非感受性変異株について、異なる2プールから同じ領域にマップされた変異株が取れているため、これらは同一遺伝子に変異を持つ可能性が高く、次世代シークエンスを用いて、原因遺伝子の特定を試みる。
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| 今後の研究の推進方策 |
115C07化合物の標的受容体における解析は、大腸菌によるABA受容体の発現系が構築できたことから、in vivoでの特定はほぼ間違いなく実施可能である。たとえ、115C07が植物体内で代謝されて、代謝物が異なるABA受容体を標的にしていたとしても、シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析により、115C07代謝物が生体内で標的とする受容体を特定できる可能性が高いと考えている。ABA受容体変異株の中で、PYL3, PYL7, PYL10はT-DNA変異株が存在していないため、ゲノム編集技術により、これらの遺伝子を破壊した植物体を作成しておく必要性もあると考えている。そこで、CRISPR/Cas9によるPYLs遺伝子の破壊を試みる。
In vitro解析と植物遺伝学的解析で、115C07標的受容体が異なる場合は、115C07代謝化合物が真に生体内で機能する選択的ABAアゴニストであると想定される。この結果が得られた場合、115C07代謝物の同定をフォトダイオードアレイによるHPLCシステムと質量分析から、代謝物の同定を行う。同定した代謝物を化学合成し、生化学的解析により、代謝物前と後の115C07の作用相違を徹底的に調べる。
115C07非感受性変異株については、次世代シークエンスを用いて、原因遺伝子の特定を試みる。詳細な表現型の解析から、異なる遺伝子をコードしている可能性のあるものに関しては、同様に、次世代シークエンスによる原因遺伝子の同定を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
補助金に関しては計画通りに全額使用した。基金分の270万円に関しては、研究の進展状況に依存して必要となる機器の購入のために次年度へ持ち越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
持ち越した基金分を有効に活用し本年度の研究費と合わせることで、115C07化合物の代謝物同定のための遠心濃縮機あるいはHPLCシステムの購入を予定している。
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