| 研究課題/領域番号 |
26712006
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (60560779)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / RNAサイレンシング / 順遺伝学スクリーニング / 宿主因子 / tasiRNA |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、ランダムtasiRNAライブラリーの構築を行った。はじめに、Arabidopsis thalianaのTAS1c遺伝子のD3(+)、D4(+)の二ヶ所から二種類のランダムtasiRNAを発現させるためのTAS1c-D34ベクターを構築した。このTAS1c-D34ベクターにランダムなtasiRNAを挿入することに成功した。30コロニーの大腸菌よりプラスミドを抽出し、挿入された60種類の人工tasiRNA配列の標的mRNAを予測した。その結果、得られた人工tasiRNAの約半分には標的mRNAが無いことが判明した。
この結果を受けて、当初の計画を変更し、TAS1cのD2(+)、D3(+)、D4(+)の三ヶ所から三種類の人工ランダムtasiRNAを発現させるように改変したTAS1c-D234ベクターを構築した。このベクターにも人工ランダムtasiRNAを挿入することに成功した。30コロニーの大腸菌よりプラスミドを抽出し、挿入された90種類の人工tasiRNAの標的mRNAを予測した、その結果、各コンストラクトあたり少なくとも一つのmRNAを標的とする人工tasiRNAをもつ集団が構築できたことが明らかとなった。これらの結果より、改変TAS1c-D234ベクターを用いてランダムtasiRNAベクターを作成することにした。
次に、ランダムな人工tasiRNAをもつプラスミドをエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウムに形質転換し、選択培地上で生育させたアグロバクテリウムの各コロニーがランダムなtasiRNAを含むかどうかを評価した。30コロニーのアグロバクテリウムより人工tasiRNA領域を増幅し、シークエンス解析を行った。その結果、ランダムな外来tasiRNAをもつアグロバクテリウムライブラリーの構築に成功したことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
植物育成室にアザミウマが大量発生し、一旦すべての植物を廃棄することになったため。二種類の農薬を利用するなど、防虫対策を施した。
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| 今後の研究の推進方策 |
一年目の研究計画分の遅れを取り戻すべく、植物育成棚の増設を行う。また、より効率よくウイルスの感染を評価するために、GFPを用いてCMVの増殖を可視化する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
先の項で述べた通り、実験の進展が当初計画より遅れたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
スクリーニングを効率よく進めるために、GFPを用いてCMVの感染を可視化する。CMV感染の有無・効率を評価するために実体蛍光顕微鏡を導入する計画である。
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