研究課題
植物は土壌中/植物体内のミネラル栄養濃度をセンシングし、輸送系を制御して変動するミネラル環境に適応している。ホウ酸は植物の生育に必須であるが過剰に蓄積すると毒ともなる。シロイヌナズナBOR1はホウ酸の細胞外への排出を促進する細胞膜局在型ホウ酸トランスポーターであり、低ホウ酸条件時にホウ酸の導管方向への輸送を担う。BOR1は高ホウ酸濃度にさらされると細胞膜から液胞に輸送され、分解される。本研究では、BOR1がレセプター(トランスセプター)としてホウ酸濃度をセンシングし、自身の蓄積量を制御して適切なホウ酸輸送量を保つ可能性を検証している。昨年度までの順遺伝学的な解析結果とBOR1タンパク質の構造予測により、輸送基質としてのホウ酸の結合サイトを形成するアミノ酸がホウ酸に応答した分解に重要であることが考えられた。本年度は、これを定量的に示すため、各変異型BOR1を安定発現する形質転換シロイヌナズナと酵母発現ベクターを整備し、輸送活性と分解性の解析の一部を行った。これまでに得た結果は、活発なホウ酸輸送がBOR1のユビキチン化と分解を引き起こす、すなわちホウ酸輸送とセンシングが共益する可能性を支持している。本研究ではまた、BOR1の分解応答の全体像を理解するためBOR1の細胞内輸送のメカニズムを逆遺伝学的に解析している。本年度は特に、BOR1のエンドサイトーシスはダイナミン様タンパク質DRP1Aとクラスリンに依存することを明らかにした。さらに、BOR1の細胞内輸送におけるクラスリンアダプタータンパク質等の使い分けの解析を進めた。これと関連して、ホウ酸チャネルNIP 5;1の偏在性維持にクラスリンアダプタータンパク質複合体AP2に依存したエンドサイトーシスが重要であることを明らかにした。
2: おおむね順調に進展している
BOR1のエンドサイトーシス系分解に重要なBOR1内部のアミノ酸の機能解析を進めている。当初、各アミノ酸置換型BOR1は出芽酵母においてホウ酸輸送活性を失うか弱まったものの、シロイヌナズナbor1-1変異株に発現させた際に野生型と同様なホウ酸輸送活性を示すという矛盾した結果が得られた。そこで予定を変更し、内生のBOR1およびそのホモログであるBOR2の影響を全く受けないよう、bor1bor2 double KO株に各アミノ酸置換型BOR1-GFPを導入した。この際、ホモロジーモデリングによるBOR1の構造予測により、直接的にホウ酸に結合するアミノ酸を予測し、解析対象に加えた。各アミノ酸をアラニンに置換した変異型BOR1-GFPを発現する形質転換シロイヌナズナの整備はほぼ完了し、各変異型BOR1の酵母発現ベクターも構築した。部分的にこれらを用いた解析結果も得られている。また、BOR1の分解応答の全体像を理解するためBOR1の細胞内輸送について逆遺伝学的な解析を進めた。ダイナミン様タンパク質の解析を通してBOR1のエンドサイトーシスの主要な部分はクラスリン依存エンドサイトーシスによることを明らかにし、Plant Cell Physiology誌に発表した。また、クラスリンアダプタータンパク質AP複合体1/2/3/4や、ユビキチン化を認識してクラスリン小胞に詰め込むアダプター候補であるTOLタンパク質ファミリーについて解析を進めた。その結果、BOR1-GFPのエンドサイトーシスにAP2が、液胞輸送にAP4と複数のTOLが重要であることを見出した。これと関連して、ホウ酸チャネルNIP 5;1の偏在性維持にクラスリンアダプタータンパク質複合体AP2に依存したエンドサイトーシスが重要であることを明らかにし、その他の結果と合わせてThe Plant Cell誌に発表した。
BOR1内部のアミノ酸の役割の解析をさらに進める。昨年度に引き続いて各アミノ酸置換がBOR1のホウ酸輸送活性と自己のユビキチン化および分解応答に与える影響を定量的に評価する。また、MS解析と抗体を用いた解析によりユビキチン化の種類とユビキチン化されるリジンの確定を行う。これらによって、<ホウ酸を活発に輸送する形態がユビキチン化を受けて分解されやすい形態である>という仮説の証明を目指す。BOR1分解シグナリング系の全体像を明らかにするためには、小胞輸送に関する因子の逆遺伝学的な解析に力を入れる。クラスリンアダプタータンパク質として知られるAP複合体1/2/3/4と、ユビキチン化を認識してクラスリン小胞に詰め込むアダプターと考えられるTOLsについての解析を進める。各変異株におけるBOR1-GFPの挙動の解析は順調に進んでおり、結論が得られると考えている。一方BOR1と各アダプタータンパク質の相互作用については、これまで複数の方法を用いながらも確定的な結果を得ていない。本年度は主にBiFC法により解析する。代表者らは別研究課題において細胞内ホウ酸濃度レポーターを開発している。これは、ホウ酸チャネルNIP5;1の5’UTR領域がホウ酸濃度に応じてmRNA分解により下流の遺伝子発現を抑制する現象を利用したもので、主にproUBQ10:NIP5;1 5’UTR:3xVenus-NLSというコンストラクトを使用している。原理的に植物体のすべての細胞において、相対的なホウ酸環境をマップすることができる。ホウ酸センシングの研究にも本レポーターを活用し、ホウ酸センシングの生理学的な意義を明らかにする。
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The Plant Cell
巻: 29 ページ: 824-842
10.1105/tpc.16.00825
Plant Cell Physiology
巻: 57 ページ: 1985-2000
10.1093/pcp/pcw121
http://saibaiseirigaku.wixsite.com/crop-ecophysiology
