| 研究課題/領域番号 |
26712011
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
宮崎 亮 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 研究員 (80712489)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現 / 微生物 / ゲノム |
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| 研究実績の概要 |
遺伝的にクローナルな細菌細胞集団を実験室内の制御された条件下で培養しても、個々の細胞における遺伝子発現レベルには「ばらつき」が存在する。このばらつきが生み出す分子メカニズムや細胞内反応を明らかにするために、本年度は、Pseudomonas属細菌の遺伝子水平伝播に関与する不均一な遺伝子発現に着目し、当該遺伝子を発現している一部 (3-5%) の細胞集団 (サブ細胞集団) と発現していないその他の集団 (母集団) を蛍光顕微鏡およびセルソーターで正確に分離する条件を検討した。通常、分離後の非常に少数の細菌細胞からトランスクリプトームに供するだけのRNAを回収するのは困難であるが、細胞の分離方法とRNAの抽出法に工夫を加えることで、RNA-seq解析に必要なRNA量を効率よく回収することができた。相対定量RT-PCRを行ったところ、母集団よりもサブ細胞集団から抽出したtotal RNAに標的遺伝子のmRNAがより多く含まれていることが確認されたことから、本系で抽出したRNAはその質としても細胞の生理状態を反映した健全なものであることが示唆された。抽出したRNAからrRNA除去後にcDNAの合成・増幅、ライブラリー作製を行い次世代シーケンサーで解読したところ、各サンプルとも十分量のリードが得られた。現在は、サブ細胞集団と母集団に特異的な遺伝子発現変動を明らかにするために情報科学的な解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞集団における遺伝子発現の不均一性を、細菌一細胞レベルで検出・解析するための顕微鏡システムやセルソーターなどのハード面のシステムを構築するとともに、それらを使用して少数細胞からのRNA抽出法を確立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seqデータの情報科学的解析を進め、サブ細胞集団ごとの特異的な遺伝子発現変動を見出す。必要であれば検体数を増やし、より精度の高いRNA-seqデータを集める。その後、RNA-seqのプロファイルから不均一性を生み出す候補因子を洗い出し、遺伝子破壊等の遺伝学的アプローチによってそれらの機能を明らかにする。現在扱っているPseudomonoas族細菌の遺伝子水平伝播に関わる不均一性についてまとめた後、他の微生物の様々な不均一性についても解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代シーケンスなどの外注分析サンプルの準備が年度末になり、納品・支払いが翌年度になったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次世代シーケンスの外注分析サービスにおいて、検体数が増える予定なので、その補填に使用する予定である。
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