| 研究課題/領域番号 |
26712024
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
山田 健太郎 大分大学, 医学部, 助教 (70458280)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 狂犬病ウイルス / 増殖性 / 弱毒化 / N型糖鎖 / 相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、狂犬病ウイルス街上毒株におけるG蛋白質へのN型糖鎖追加が規定する増殖性亢進機構と弱毒化機構について、それに関わる宿主分子を明らかにし、さらにその分子が狂犬病の治療法・治療薬の標的となり得るかについて検証することを試みるものである。
増殖性亢進機構解明に向けては、今年度は、狂犬病ウイルス街上毒1088株（野生型）G蛋白質をBaitに、マウス脳由来cDNAライブラリーをPreyとした膜蛋白質酵母ツーハイブリット法により、小胞体・ゴルジ装置等の膜系細胞小器官内においてG蛋白質と相互作用する宿主分子のスクリーニングを行った。結果として、67種類の候補分子が得られたが、これらのうち非特異的相互作用が強く想定されるもの、膜蛋白質でないもの、トポロジー的に正しくないものを除外し、最終的に22種類の候補分子が得られた。
弱毒化機構解明に向けては、in vivoイメージングと次世代シーケンサー（RNA-Seq）を併用することにより、弱毒化に関連する宿主分子の同定とその発現部位および時期を明らかにすることを計画しており、今年度はまず、そのための赤色蛍光蛋白質（E2-Crimson）発現組換え1088株（野生株およびN型糖鎖追加変異株）の作出を試みた。ウイルス作出のためのゲノムプラスミドに関しては、野生株とN型糖鎖追加変異株（L38RおよびR196S）について、それぞれ野生型およびE2-Crimson発現型を構築した。しかし、組換えウイルス作出については、本年度末の時点で遺伝子組換え実験大臣確認申請の審査中であったために行っていない。また、ウイルス感染マウスのin vivo蛍光イメージング解析に向けた予備的検討を行い、クロロフィルフリーの餌が解析に適していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
増殖性亢進機構解明に向けた解析については、1088株G蛋白質（野生型）と相互作用する宿主分子候補が得られ、今年度はおおよそ計画通りに進んだと考えている。
しかしながら、弱毒化機構解明に向けた解析については、in vivoイメージング解析に資する組換えウイルスのためのゲノムプラスミドの構築は完了したものの、ウイルスの作出およびそれを使用してのin vivoイメージングとRNA-Seqの併用による、弱毒化に関連する宿主分子の同定までには至っていない。なお、弱毒化に関連する宿主分子の同定は当初より2カ年計画で達成する予定であり、また、RNA-Seq解析のための実地トレーニングを受講し、サンプルができればすぐに解析に取りかかれるように準備を行った。
以上を踏まえて、達成度は「やや遅れている」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
増殖性亢進機構解明に向けては、スクリーニングにより得られた候補分子について哺乳類細胞での相互作用解析を行い、野生型G蛋白質とは結合するが、N型糖鎖追加変異体とは結合しない宿主分子の特定を試みる。さらに、その分子のノックダウン・ノックアウトにより、培養細胞における野生型ウイルスの増殖性が亢進するかどうかについての検証も試みる。
弱毒化機構解明に向けては、H27年度の4月中に大臣確認実験申請の承認が得られる見通しであり、承認通知が届き次第、構築したゲノムプラスミドより組換えウイルスの作出を行う。続いて、それを用いてのin vivoイメージングとRNA-Seqの併用により、弱毒化に関連する宿主分子の同定とその発現部位および時期を明らかにすることを目指す。RNA-Seqにより見出した宿主遺伝子の発現については、定量RT-PCR、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学染色等による確認も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
狂犬病ウイルス感染マウスのin vivoイメージング解析を行うにあたり、今回、in vivoイメージング装置を本研究予算で購入したが、予備的検討において、実験遂行のためには小動物用吸入麻酔器が追加で必要になることが判明した。本年度の残予算では吸入麻酔装置の購入には少し不足していたため、次年度に繰り越して吸入麻酔装置の購入費に充てることにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
繰越した助成金は、翌年度請求分の研究費と併せて、今回導入したin vivoイメージング装置仕様の小動物用吸入麻酔器の購入・取付費用に充てる予定で、H27年度のできる限り早い時期での麻酔器の導入を計画している。
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