| 研究課題/領域番号 |
26712024
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
山田 健太郎 大分大学, 医学部, 准教授 (70458280)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 狂犬病ウイルス / 病原性 / N型糖鎖 / in vivoイメージング / 近赤外蛍光蛋白質 / リンパ節 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、狂犬病ウイルス街上毒株においてG蛋白質へのN型糖鎖追加が規定する増殖性亢進機構と弱毒化機構について、それに関わる宿主分子を明らかにし、その宿主分子が狂犬病の治療法・治療薬の標的となり得るか検証することを試みるものである。
増殖性亢進機構の解明にに向けては一昨年度に酵母膜蛋白質ツーハイブリッド法によるスクリーニングで得られた街上毒1088株G蛋白質（野生型）と相互作用する22種類の候補宿主分子のうち、信頼性の高かった上位4つの分子について、CRISPR-Cas9法によるノックアウト細胞の作製を開始した。
一方、マルチモーダル（蛍光・発光）in vivoイメージング法と網羅的発現解析の併用による弱毒化機構解明に向けて、今年度も引き続き、ウイルス感染をトレースするためのin vivo蛍光イメージング法について確立を試みた。昨年度の赤色蛍光蛋白質E2-Crimsonを発現する1088株に加えて、赤色蛍光蛋白質Katushka2Sもしくは近赤外蛍光蛋白質（iRFP670、iRFP720）を発現する1088株を作製し、感染マウスにおいて比較解析を行った。その結果、iRFP720が最もin vivo蛍光イメージングに適していることが分かった。この結果をもとに、iRFP720を発現するN型糖鎖追加変異株についても2株作製した。
また、弱毒化機構解明について局所リンパ節の観点からのアプローチを行ったが、マウスでの感染実験において所属リンパ節が弱毒株の排除に関わることを示す結果は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
増殖性亢進機構の解明に向けては、当初の計画通りに野生型G蛋白質と相互作用するが、N型糖鎖追加変異株とは相互作用しない宿主分子の特定に至ることができなかった。
また弱毒化機構解明に向けても、ウイルス感染をトレースするための手法を確立し、比較解析のための弱毒株の作製まではできたが、確立した系等を利用して弱毒株が宿主免疫反応を惹起する組織の特定およびそこで発現し弱毒化に関連する宿主分子の発見に至ることができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
増殖性亢進機構解明については、候補宿主分子についてノックダウン細胞を作製し、野生型G蛋白質を有するウイルスでも効率良く増殖するものを特定する。その後、G蛋白質と宿主分子の実際の相互作用については各種定法により確認する。
弱毒化機構解明に向けては、作製したiRFP720発現ウイルス（野生株・変異株）について、免疫反応発光指示薬を用いたin vivoイメージングを行い、弱毒変異株が免疫反応を惹起する部位・組織を特定する。さらに、そこで有意に発現する弱毒化に関連すると考えられる遺伝子を網羅的解析により選別し、治療法への応用について検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に動物実験を予定していたが都合により行えず、その分が次年度使用額として生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額については、翌年度請求分の研究費と併用して、動物実験用の費用（炎症反応発光指示薬、麻酔薬、マウス購入費等）に充てる予定で、H29年度の早い時期での使用を予定している。
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