研究課題
本研究は、飼育に労力やコストを要する非モデル動物のゲノム配列について、オーソログ領域に置換したマウスを作出し、個体レベルで非モデル動物のゲノム配列機能を解析することが可能であるか、その方法論の検証を目的としている。ゲノム改変可能領域を拡張するために、C. jejuni由来のCRISPR/Casによる受精卵を介したゲノム改変個体作製について検討した。データーベース情報よりORFを取得し、合成mRNAを受精卵に導入したところ、既報とは異なり、5'-NNNVRYACをPAMとした場合に標的への変異導入が認められた。導入受精卵を移植したところ、ノックアウトマウスが得られた。また、ssODNとの共注入によって、ノックインが可能であることも確認した。前年度より作製したキリン特異的Fgfrl1多型を導入したマウスをbi-allele化したが、骨形成等の形態に影響は認められなかった。キリン遺伝子背景で検討する必要があると考え、キリン培養細胞を入手し、遺伝子導入が可能な実験系の確立を行った。今後、Fgfrl1の標的座位に対して変異を導入し、Fgfrl1および関連遺伝子の発現を観察する予定である。モザイク回避を目的として、前年度に未受精卵を用いたゲノム改変手法を確立したが、本年度は受精卵を用いてモザイク回避を行う技術について検討した。卵割後のCRISPR/Casの失活を目的として、Anti-CRISPR proteinの受精卵への応用を検討したところ、通常の配列ではCRISPR/Casを失活できないが、核移行シグナルを付加することで正確に失活できることを見出した。また、受精卵における迅速な遺伝子制御技術を確立するために、Cas13aによるRNA制御系およびTrim21によるタンパク質制御系を検討し、現在ゲノム領域置換への応用を進めている。
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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