| 研究課題/領域番号 |
26713011
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
川根 公樹 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (60362589)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞死 / 上皮細胞 / 腸管 / 細胞脱落 / 小腸 |
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| 研究実績の概要 |
上皮細胞は組織から脱落してその一生を終える。死ぬべき細胞は隣接細胞が生み出す力により押し出され、組織から脱落する。本研究は、腸上皮のターンオーバーでの脱落を対象に、以下のアプローチを用いて脱落の分子機構の解明を行う。1 時間経過が細胞にもたらす変容をオミクス解析により明らかにし、寿命を迎えた細胞に何がおこり脱落のタイミングが決定されるかを明らかにする。2 脱落運命の決定された細胞はどのように隣接細胞に感知され、隣接細胞はどのように細胞を押し出すためのアクチンリングの形成を開始するかを明らかにする。そのためショウジョウバエにおいてRNAiスクリーニングを実施する。3 アクチンリングのどのような動態変化が力を発生して細胞を押し出すのか、その際細胞間接着がどのように喪失、再形成されるかをマウス腸培養組織培養や培養細胞を用いたライブイメージングによって解明する。
1 前年度までに、マウス腸上皮を用いて行ったマイクロダイセクション及びマイクロアレイ解析から脱落に関与する可能性のある候補遺伝子の抽出を行った。本年度は各遺伝子の腸上皮での発現パターンをin situ hybridizationで解析し、脱落のおこる絨毛先端部で発現が上昇する遺伝子を複数同定した。
2 前年度までに、腸上皮細胞で誘導した各RNAiの効果を細胞数や細胞の形態などの複数パラメーターで評価する一次スクリーニング系を構築した。本年度はこれを用い、500系統(遺伝子)のスクリーニングを行い、約40系統の陽性結果を得た。
3 前年度までに、培養細胞を用いた細胞脱落の解析系を構築した。本年度はこれを用い、細胞接着分子と蛍光タンパクの融合タンパクを用いて細胞脱落時のこれらの動態解析を行った。その結果、細胞脱落の際、タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションは異なる挙動を取ることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要の欄に記載したように、研究計画1, 2, 3のいずれにおいても計画した研究の進展が見られ、特に3については、細胞脱落時の細胞接着の動態を明らかにできた。これらの理由より、「(2) おおむね順調に進展している 」の区分とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
H29年度は、研究実績の概要の欄に記載した1-3のアプローチに対し、以下のように研究実施を計画する。
1 本年度に実施した in situ hybridizationによって同定された、マウス小腸の絨毛先端部で発現が上昇する遺伝子について、これらが細胞脱落に関与するかどうかを、哺乳類培養細胞、マウス小腸オルガノイド、ショウジョウバエ生体上皮などの実験系において、遺伝子ノックダウン (RNAi)を用いて検証する。
2 本年度に続いて一次スクリーニングを継続するとともに、既に一次スクリーニングにおいて陽性結果を得た約40の遺伝子について二次スクリーニングを実施する。二次スクリーニングでは、RNAiを誘導したショウジョウバエ腸上皮において脱落の実行装置であるアクチンリングを検出することで、脱落細胞の数を直接定量して評価を行う。
3 哺乳類培養細胞及びマウス小腸オルガノイドの実験系において細胞骨格分子の動態解析を行い、細胞接着分子の動態との関連を明らかにするとともに、これら分子動態を制御する機構について、RNAiまたは各種阻害剤とライブイメージングを組み合わせて解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体、培養試薬等の物品 (消耗品)に、他の研究課題と共通で使用するものがあり、それらの一部を他の研究資金で購入出来た。また本年度は、多くの実験について進捗が見られ、次年度は新規知見をもたらす実験を数多く計画している。よって次年度は、多額の消耗品費用が必要となることに加え、アルバイトを雇用して研究の迅速な進展をはかりたいと考え、研究費の一部を、本年度よりも次年度に使用することが望ましいと考えた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細胞培養用の血清、大量のショウジョウバエ飼育にかかるバイアルなどの消耗品に使用する。また、アルバイト雇用のための人件費に使用する。
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