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2014 年度 実績報告書

多能性幹細胞を用いた三次元精巣組織の再構築による完全体外精子形成法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26713012
研究機関横浜市立大学

研究代表者

佐藤 卓也  横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (70599505)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2018-03-31
キーワード精子形成 / 器官培養 / 精巣 / セルトリ細胞
研究実績の概要

我々は、精子形成には精巣組織に特有のチューブ構造をもった3次元構造が重要であるという観点に基づき、器官培養法によるin vitro精子形成法を開発してきた。そして、精子幹細胞から妊孕能を有する機能的な精子へ分化誘導する方法の開発に成功している。この実験系における問題は、マウス個体から採取された組織に依存した方法であるという点である。したがって、本研究課題では、多能性幹細胞(ES細胞)からin vitroで精巣細胞を分化誘導し、立体的な精巣組織を構築する方法の開発を行う。そして最終的には、その再構築精巣を器官培養し、精子幹細胞から妊孕能のある精子産生までの全ての過程をin vitroで再現可能な方法を構築することを最終目的とする。
初年度は、研究を進めるために必要なレポーターマウスの導入や、ES細胞を培養するための環境作りを行った。レポーターマウスとして、Dhh-creあるいはAmh-creマウスとCAG-floxed Neo-GFPマウスと交配したマウスを使用することとした。DhhやAmhは、主にセルトリ細胞で発現する遺伝子であり、これらのマウスは、セルトリ細胞がラベルされることが報告されている。さらに、同様にセルトリ細胞でGFPを発現するSox9-GFPマウスを入手した。これらのマウスの胚盤胞からES細胞の樹立を行った。
一方で、精子幹細胞の遺伝子改変は、その効率が低く大変困難な技術となっている。精子幹細胞の効率的な遺伝子改変技術が開発されれば、精子形成メカニズムの解明や、in vitroでの精子形成システムの開発にも有用である。そこで、TALENやCRISPR/Cas9システムといった近年注目されるゲノム編集技術が、精子幹細胞の遺伝子改変においても有効かどうか調べた。その結果、ゲノム編集技術により、高効率でノックインが可能になることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

レポーターマウスとして導入したDhh-creとAmh-creマウスは、当研究室で発現パターンを解析したところ、残念ながら過去の報告通りではなかった。原因は不明であるが、飼育中に何らかの問題が生じ、トランスジーンの発現が抑制されたものと思われる。したがって、本実験のためには使用できなくなってしまった。そのため、研究の進展が遅れる結果となってしまった。その後、入手したSox9-GFPマウスから樹立したES細胞を使い、今後研究を進めることとした。

今後の研究の推進方策

Sox9-GFPのES細胞を樹立することができたので、今後、このES細胞を使用し分化誘導実験を本格的に進めていく予定である。具体的には、近年、複数報告されている中間中胚葉を経由した腎臓細胞の分化誘導法(精巣細胞は細胞の起源が近い)をもとに培養条件を種々検討していく計画である。また、GFPを発現する細胞が現れた場合、その細胞と精巣細胞とを混合し、精巣を再構築することで、GFP陽性細胞が精巣組織へ寄与するかどうかを評価する。

次年度使用額が生じた理由

研究に使用予定するために購入したマウスの表現型が想定と異なっており、別のマウスを使用を検討するなど、実験計画を見直さざるを得なくなった。そのため研究のに遅れが生じ、研究費に残額が生じた。

次年度使用額の使用計画

精巣細胞の分化誘導条件の検討を本格的に進める予定ある。そのために、網羅的に培養液・成長因子などを加え調べていくので、研究費の大部分はそれらの消耗品にあてる予定である。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Offspring production with sperm grown in vito from cryopreserved testis tissues2014

    • 著者名/発表者名
      Yokonishi, T. Sato, T. Komeya, M. Katagiri, K. Kubota, Y. Nakabayashi, K. Hata, K. Inoue, K. Ogonuki, N. Ogura, A. Ogawa, T.
    • 雑誌名

      Nature communications

      巻: 5 ページ: 4320

    • DOI

      10.1038/ncomms5320

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] 精子幹細胞と精子形成:ex vivo cultureの可能性2014

    • 著者名/発表者名
      佐藤卓也・横西哲広・小川毅彦
    • 雑誌名

      実験医学

      巻: 32 ページ: 859

  • [学会発表] 器官培養による成熟マウス精巣のin vitro精子形成2015

    • 著者名/発表者名
      佐藤卓也、片桐久美子、小島一晃、古目谷暢、矢尾正祐、小川毅彦
    • 学会等名
      第10回日本生殖再生医学会
    • 発表場所
      メルパルク京都(京都府京都市)
    • 年月日
      2015-03-22 – 2015-03-22
  • [学会発表] ゲノム編集技術をもちいた培養精子幹細胞株の遺伝子改変法の開発2014

    • 著者名/発表者名
      佐藤卓也、佐久間哲史、片桐久美子、越後貫成美、小倉淳郎、山本卓、小川毅彦
    • 学会等名
      第37回分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27

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公開日: 2016-06-01  

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