| 研究課題/領域番号 |
26713016
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
新崎 恒平 東京薬科大学, 生命科学部, 講師 (70609990)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | レジオネラ / レジオネラエフェクター / Rabタンパク質 / 小胞輸送 / リソソーム / 小胞体 |
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| 研究実績の概要 |
本申請研究は、「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」、「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」、「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」を主体として行なっており、各々の進捗状況を以下に記載する。
「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、昨年度までにRab6がLCVに集積することがLCVの小胞体への移行過程に必要であること、また、Rab6のLCVへの集積はRab33bを介して引き起こされることを見いだしている。このことから、レジオネラは小胞体へと向かう際に、LCV上でRab33b-Rab6というカスケードを利用していることを明らかにしている。本年度はRab33bをLCVへ集積させる為のレジオネラエフェクターの同定を試み、Rab33bをLCVへと供給させるレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定に成功し、候補となるエフェクターを数種類同定している。
「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、昨年度までにRab5をユビキチン化し分解するレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定まで成功していたが、本年度はRab5に対するE3ライゲースの候補の同定まで成功した。更に、当該エフェクターを単独で培養細胞に発現させるだけで、Rab5のユビキチン化及び分解が起こることを見いだした。
「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、昨年度までにレジオネラがまず滑面小胞体と接触した後に粗面小胞体へと移行し増殖すること、また滑面小胞体から粗面小胞体への移行にBap31と呼ばれる宿主タンパク質を利用していることを見いだした。本年度は、レジオネラが小胞体へと到達した後に、Bap31を利用するレジオネラエフェクターをコードしている遺伝子群の同定まで成功している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、Rab6のLCVへの集積にはRab33bが必要であることから、何らかのレジオネラエフェクターがRab33bをLCVにリクルートしていると考えた。そこで、レジオネラエフェクターをコードする複数の遺伝子群を欠損した株を用いて解析を行なったところ、一つの遺伝子群の欠損株においてLCVへのRab33bの集積が消失した。また、本遺伝子群にはRabと結合するモチーフを持ったエフェクターがコードされており、現在Rab33bとの相互作用を検討している。
「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、Rab5に対するE3ライゲース活性を持つレジオネラエフェクターの同定に成功しており、当該エフェクターを細胞内に発現させるとRab5のユビキチン化及びRab5のタンパク質量の減少を検出することが出来た。また、当該エフェクターの遺伝子破壊株の作製も完了しており、本株の感染においてRab5のユビキチン化が検出されなくなることから、レジオネラ感染においてRab5をユビキチン化する責任分子を同定することに成功した。
「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、レジオネラが滑面小胞体から粗面小胞体への移行する過程において、Bap31（宿主細胞内において滑面小胞体と粗面小胞体を循環するタンパク質）を利用していること、及びBap31がLCV上に有意にリクルートされることから、何らかのレジオネラエフェクターがBap31の機能をハイジャックしていると考えた。そこで、上記したレジオネラエフェクター遺伝子群欠損株を用いて解析を行なったところ、一つの遺伝子群の欠損株においてBap31のLCVへの集積が顕著に抑制されていた。このことは、当該遺伝子群にBap31をLCVへと供給させるエフェクターがコードされていることを示している。
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| 今後の研究の推進方策 |
「レジオネラ感染経路に関与するRabタンパク質の同定」においては、Rab33bをLCVへと集積させるレジオネラエフェクターの解析を主に行なう。レジオネラエフェクターにはRabを含む低分子量GTP結合タンパク質をGDP型からGTP型に活性化（GEF活性）させるエフェクターが多く存在している。そこで、今回同定したRab33bをLCVに集積させるレジオネラエフェクターがRab33bに対してGEF活性を有しているのかをリコンビナントタンパク質を用いた系により解析する。また、当該エフェクターの遺伝子破壊株も作製し、本エフェクターの欠損がRab33bやRab6のLCVへの集積に与える影響を解析する。
「LCVのリソソーム融合阻害機構の解析」においては、E3ライゲースとしてRab5をユビキチン化し分解させるレジオネラエフェクターを同定できたことから、E3ライゲースとして重要なアミノ酸の同定を試みる。一般的にE3ライゲースには基質にユビキチンを付加するモチーフがあり、当該エフェクターにも同様のモチーフが存在していることから、そのモチーフ内のアミノ酸を変異させることで重要なアミノ酸を決定する。また、当該エフェクターの遺伝子破壊株でRab5のユビキチン化が抑制されていることから、Rab5非ユビキチン化変異体を遺伝子破壊株に戻すことで、レジオネラによるRab5のユビキチン化がレジオネラ感染にどのような利点を与えているのかを解析する。
「レジオネラ感染に関与する小胞体サブドメインの同定」においては、宿主細胞において滑面小胞体と粗面小胞体を循環できるBap31を利用するレジオネラエフェクターをコードする遺伝子群の同定まで完了していることから、本遺伝子群からBap31を利用しているエフェクターを絞り込む。絞り込みが完了したのち、当該エフェクターの機能解析や遺伝子破壊株の作製を行なう。
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