| 研究課題/領域番号 |
26713030
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
武内 敏秀 京都大学, 化学研究所, 助教 (70600120)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ポリグルタミン病 / ドラッグデザイン |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ポリグルタミン（PolyQ）タンパク質に選択的結合活性、凝集阻害活性を有するペプチドQBP1の構造情報をもとにして、凝集阻害化合物の開発を目指す。本年度は、PolyQタンパク質とQBP1ペプチドとの結合様式について検討を行った。まず、モデルPolyQタンパク質であるチオレドキシン融合PolyQタンパク質（Thio-PolyQ）を大腸菌発現系で調製し、これが経時的、濃度依存的、PolyQ鎖長依存的に凝集体を形成することを確認した。また、等温滴定型カロリメトリー（ITC）により、Thio-Q62に対するQBP1の結合定数、結合比を推定した。次に、Thio-Q62/QBP1複合体におけるQBP1のNMR立体構造解析を行うため、15NラベルしたQBP1（15N-QBP1）を調製した。15N-QBP1をチオレドキシン融合タンパク質として大腸菌発現系により合成し、この融合タンパク質からチオレドキシン部を酵素的に除去後、HPLC精製およびMS確認により、15N-QBP1を得た。この15N-QBP1を用い、ITCにより得られた結合モードに基づいてThio-Q62と複合体を形成させ、NMR測定を試みた。その結果、15N-QBP1に由来するNMRスペクトルが観測されたものの、著しく減弱しており、15N-QBP1のみ（Thio-Q62なし）のスペクトルとほぼ同一であった。これは、15N-QBP1がNMR測定中に凝集体に取り込まれた結果であると考えられ、Thio-Q62はQBP1存在下においても微細な凝集体を形成し、NMR測定が困難であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ポリグルタミンタンパク質Thio-PolyQの大腸菌発現系を確立し、Thio-Q62とQBP1との相互作用様式を明らかにした。また、結合モードに基づいたNMR測定を行った。いくつかの問題点が明らかになったものの、初年度に予定していた実験系の立ち上げが順調に進んだと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度の検討により、Thio-Q62を用いたNMR解析が困難であることが明らかとなった。今後は、Thio-Q62の代わりに、より凝集性の低い短鎖PolyQタンパク質であるThio-Q45およびThio-Q35を用い、再びNMR測定を試みる。これと同時に、動的光散乱光度計により、複合体溶液内の粒子径測定を行い、QBP1存在下におけるThio-PolyQの微細な凝集体についても調べることにする。また、短鎖PolyQタンパク質を用いたNMR測定においてもQBP1シグナルがうまく観測されない場合は、Thio-PolyQの代わりにより凝集性の低いグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合PolyQタンパク質を用いて検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、実験補助員の雇用を予定し、そのための人件費を申請していた。しかし、適任者がなかなか見つからず、補助員の雇用開始が予定よりも遅くなったために次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今回生じた次年度使用額は、次年度以降の補助員に対する人件費に使用する予定である。
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