| 研究課題/領域番号 |
26713045
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
池淵 祐樹 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20645725)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 関節リウマチ / RANK-RANKL相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、RANKL分子が骨代謝において双方向性のシグナル分子として機能することを見出したことに端を発し、関節リウマチの発症・増悪機構への「RANKL逆シグナル」の関与を想定している。関節リウマチの進行と共に認められるT細胞バランスの破綻や滑膜細胞の過剰な増殖に関して、「RANKL逆シグナル」に着目した新たな制御・治療法の提案を最終的な目標としている。
初年度においては、T細胞、滑膜細胞の各モデル細胞株を用いた解析により、RANKL逆シグナルによる影響評価を計画していた。しかしながら、当初の計画と順序を入れ替え、研究期間1年目は生体での評価系の構築を優先して進めた。具体的には、RANKLの細胞内領域に点変異を導入したノックインマウスの繁殖、卵巣摘出モデルマウス、コラーゲン誘発性関節炎モデルマウスの作出を進めた。RANKL点変異導入マウスから単離した骨細胞、骨芽細胞を用いた解析からは、細胞内へのRANKL逆シグナル入力強度の低下が確認出来ており、他のRANKL分子を発現する細胞においても同様の効果が期待出来る。次年度以降、これら動物モデルを組み合わせて表現型を比較することで、RANKL逆シグナルの生理的な役割、また病態発症に与える影響の評価が期待出来る。
また、RANKL逆シグナルの入力活性を有する抗体分子の取得及び最適化を同時に進めた。これまでの解析から、RANKL分子が適切な距離間で架橋・凝集することがシグナル発生のトリガーとなることを見出しており、入力担体として抗RANKL抗体の取得をファージディスプレイ法により行った。骨粗鬆症等に使用される抗RANKL抗体製剤デノスマブがRANKL逆シグナルの入力活性を示さない一方で、アゴニスト活性を有する複数の抗体の作出が終了しており、今後の解析を進める上で重要な進展と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題が目標とする、関節リウマチの発症・増悪におけるRANKL逆シグナルの寄与の解明を達成するために、大きく分けて、(1)マウスでの解析から生体レベルでの関与を評価、(2)培養細胞を用いた細胞内シグナル経路等の詳細な解析、(3)(1)(2)に基づいた新規治療法の検証を行う。
当初計画していた順序とは入れ替えて検討を進めたが、H26年度では、(1)の解析で必要となる動物モデルの構築を中心に進めた。RANKL逆シグナルの入力強度が異なる、RANKL点変異ノックインマウスの作出・繁殖や、卵巣摘出によるRANKL発現量変動モデルの構築は順調に進んでいる。また、異種コラーゲンを免疫することで惹起する関節炎モデルの最適化も終了している。次年度以降、これらの動物モデルを組み合わせて表現型を解析することで、生体レベルでのRANKL逆シグナルの関与を評価することが可能である。
また、RANKL逆シグナルという新規の発見に基づいた解析を行うため、これを入力可能なツールが種々の解析を進める上で必須となる。抗体分子の代表的なスクリーニング手法であるファージディスプレイ法を用いて、ヒト及びマウスRANKLへの結合性を有する抗体を探索し、複数の高活性抗体を得た。さらに、RANKLへの結合親和性を向上させることで、計画する解析に十分活用可能な抗体の配列を決定出来た。現在、この抗RANKL抗体の高産生系の構築を進めており、以降の(1)及び(2)の解析において使用予定である。
以上、次年度以降の解析を進めるにあたって必要となる実験系の構築は順次進められており、本課題の進捗状況は概ね順調であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度までに繁殖・維持したRANKL点変異ノックインマウス、及び卵巣摘出マウスを用いて、コラーゲン誘発性関節炎を惹起し、その表現型を野生型マウスと比較する。組織切片での種々の染色、血清中の骨代謝・炎症マーカー・サイトカイン濃度の測定、さらにメタボローム解析等を行うことで、生体レベルでのRANKL逆シグナルの影響を評価する。メタボローム解析を行う際に使用する高分解能のフーリエ変換質量分析計は研究室に設置済みであり、実施に支障はない。
一連のマウスでの解析と並行して、前年度の検討から得られた抗RANKL抗体を用いて、T細胞、滑膜細胞におけるRANKL逆シグナルの機能を評価する。具体的には、各細胞に抗RANKL抗体を曝露し、1.未分化なT細胞から各Thサブセットへの分化運命をマーカー遺伝子の発現量変動やフローサイトメトリー等で評価、及び2.活性化T細胞からの各種サイトカインの分泌量に与える影響を検証する。また、滑膜細胞に関しても、3.増殖能の変動と細胞周期に与える影響を確かめると共に、4.活性化した滑膜細胞からの骨・軟骨基質分解酵素産生量を測定する。これらの解析において変動が認められた点に焦点を置き、関連する細胞内シグナル分子の同定を試みる。
また、関節リウマチの進行につれて破壊され、その後の再生が困難な軟骨細胞においても、RANKL逆シグナルによる分化制御の可能性を検証する。軟骨細胞の分化制御はRunxファミリー分子が中心となって行われる一方で、その上流にある刺激やシグナル経路に関しては未解明な点も多い。軟骨細胞にもRANKLが発現しており、これまでの骨芽細胞での解析との類似性から、RANKL逆シグナルを調節することで軟骨細胞の分化や基質の産生等のコントロールが可能ではないかとの着想を得た。まずは、マウス軟骨由来ATDC5細胞を用いた解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題は４年間の研究期間内に、RANKL逆シグナルが関節リウマチの発症・増悪にどのように関わっているかを明らかにし、関連する細胞内シグナル経路等の詳細な解析に基づいて、新たな治療法の可能性を探ることを目的としている。H26年度においては、生体レベルでの解析に用いる評価系の構築と、また研究期間全体を通して使用するRANKL逆シグナルの入力活性を有する抗RANKL抗体の取得を優先して進めた。そのため、当初計画していたT細胞、滑膜細胞を用いた解析と比較して、実験試薬等の消耗品にかかる費用が低く抑えられ、次年度以降へ持ち越すこととした。
H27年度以降、実験試薬や実験動物の飼育等に必要な消耗品を購入するための物品費、および研究成果を発表するための学会参加費・旅費や論文投稿費用を含む研究費（次年度使用額）として予定している。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H26年度での検討から、動物モデルの実験条件の最適化や維持・繁殖、及び培養細胞系の実験に使用する抗RANKL抗体の作出等が終了した。H27年度では、これらを用いたマウスモデルの解析の実施と種々評価法による表現型の解析と、T細胞・滑膜細胞を用いた解析を中心に研究を計画している。また、これに加えて、新たに軟骨細胞に着目して、その分化制御や基質産生能に与えるRANKL逆シグナルの影響を評価する。
申請する研究費は、これらの解析に必要な実験試薬・消耗品の購入に主に使用する予定である。
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