| 研究課題/領域番号 |
26740026
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
鈴木 哲矢 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 助教 (20573950)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | DNA二本鎖切断 / 組換え修復 / DNAヘリカーゼ / DNAリゾルベース |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、DNA鎖切断の組み換え修復に関わると考えられる遺伝子のうちDNAヘリカーゼ（WRN、RECQL5）およびDNAリゾルベース（GEN1、SLX4）を遺伝的にノックアウトしたヒト細胞株を樹立し、低用量域での遺伝毒性物質に対する感受性を野生型細胞と比較することで、遺伝毒性の閾値形成における各遺伝子の役割を明らかにするとともにノックアウト細胞を利用したDNA鎖切断を誘発する遺伝毒性物質のスクリーニング評価系を開発することを目的としている。はじめに、CRISPR/Cas9のシステムを用いてノックアウト細胞を樹立することを試みた。各遺伝子の標的塩基配列を含むguide RNAの配列を、オフターゲットを考慮に入れながら設計した。各遺伝子を標的とするsmall guide RNAとCas9を発現するプラスミドベクターを作製し、TK6細胞にエレクトロポレーション法で導入した。限界希釈法によりシングルクローンを単離後、PCRにより目的遺伝子の標的配列近傍のゲノム領域を増幅し、hetero duplex mobility assayにより変異クローンのスクリーニングを行った。WRN、GEN1については、一度のトランスフェクションで片側のアレルにのみ変異が導入されたクローンしか得られなかったため、同様の操作を繰り返し両側のアレルに変異が導入されたクローンを作製した。得られた変異クローンについて、シーケンス解析を行い、目的遺伝子の両アレルに変異が導入されているかを確認した。各遺伝子のノックアウト細胞を樹立することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
RECQL5およびSLX4では比較的高い活性を有するguide RNAの配列を速やかに設計でき、ノックアウト細胞を樹立することができたが、WRN、GEN1では活性を有し、かつオフターゲットの少ない配列を設計するのに時間が掛かかってしまった。また、使用した細胞株であるTK6細胞において、プラスミドDNAの導入効率が低く、ノックアウト細胞を得るために多くのクローンをスクリーニングする必要があったため、ノックアウト細胞の樹立までに予想より多くの時間を費やしてしまった。このように、各遺伝子のノックアウト細胞の樹立までしかできず、表現型の比較までは実施できなかったため、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は、各遺伝子（WRN、RECQL5、GEN1、SLX4）のノックアウト細胞について遺伝子突然変異頻度などの表現型を解析するとともに、様々な化学物質にばく露し、細胞毒性感受性を野生型細胞と比較することにより、どのような化学物質に対して、それぞれの遺伝子が防御的に機能しているかを解析する。トポイソメラーゼ阻害剤 (カンプトテシン、エトポシド)、DNA複製阻害剤 (ヒドロキシ尿素)、放射線類似作用を示す物質（ブレオマイシン）のDNA鎖切断を誘発することが知られている化学物質の他、比較のためにアルキル化剤、多還芳香族炭化水素、DNA架橋剤などのDNAに付加体を形成する化学物質について検討する。細胞を化学物質で処理し、MTTアッセイなどの方法で細胞毒性を調べ、各化学物質・各細胞についてIC50を算出し、野生型細胞との比較を行い、野生型細胞に比較して高い細胞毒性感受性を示す化学物質とノックアウト細胞の組み合わせを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた計画よりも研究の進捗が遅れたため、ノックアウト細胞を樹立した後の表現型の解析に必要な細胞培養用の培地やプラスチック類および遺伝子突然変異などの遺伝毒性の解析に必要な試薬などを購入しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究費の殆どは消耗品費として使用する予定である。昨年度分の残額については、昨年度に実施することができなかったノックアウト細胞の表現型の解析に必要な培地やプラスチック類および試薬など消耗品類を購入する。今年度は、細胞培養に必要な消耗品、各種化学物質およびMTT試薬などの消耗品を購入するために50万円を計上した。旅費については、20万円を計上した。英文誌への投稿のため、英文校閲及び論文投稿・別刷りの費用として10万を計上した。
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