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本研究ではヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の活性を１段階操作で簡便に蛍光検出する手法の開発に取り組んだ。HDAC はタンパク質の脱アセチル化を行い、クロマチンの構造変化を介した遺伝子発現制御に関連している。加えてがん等の発症に関わる重要な機能を持った酵素であり、標的とした薬剤の開発のためにも簡便迅速なHDAC活性検出手法が強く求められている。しかしながら既存の手法では抗体や他の酵素を用いる複数の操作が必要なことから、迅速な検出、酵素反応のリアルタイムな追跡ができないという問題点があった。そこで本研究では蛍光プローブとDNAとの相互作用変化を利用した新たな活性検出法の開発に着手した。蛍光プローブとしてDNAに結合時に蛍光を発するDNA結合色素を用い、アセチルリジンを含むHDAC基質と連結した化合物を設計・合成した。昨年度までに色素、色素と基質との間のリンカー、基質配列について検討し、脱アセチル化時にDNA存在下での蛍光強度が10倍近くまで上昇するプローブを得ることに成功した。このプローブをHDAC検出に用いたところ、リアルタイムでその反応を追跡することが可能であり、酵素反応速度の解析を行うことができた。また、種々のHDAC阻害剤の強さを迅速に評価する実験系にも応用ができることを示した。
本年度では特に基質部分の配列検討を進めた。ヒストンH3、H4由来のアセチルリジンを含む配列を選択し基質へ導入後、HDAC検出について評価したところ、周辺配列によってHDACの反応性、特異性に差が見られた。この結果はHDACにおける配列依存性について重要な知見が得られただけでなく、特異性の高い基質を有する蛍光プローブの開発にもつながると考えられる。加えて、本年度は前年度までの成果について国内学会、国際学会で発表を行い報告した。
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