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2015 年度 実施状況報告書

リン酸化シグナリング解析手法の確立とシグナル研究への展開

研究課題

研究課題/領域番号 26750372
研究機関香川大学

研究代表者

杉山 康憲  香川大学, 農学部, 助教 (10632599)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードリン酸化シグナリング / プロテインキナーゼ / マルチPK抗体 / Phos-tag SDS-PAGE / 抗がん剤 / リン酸化プロテオーム
研究実績の概要

細胞内情報伝達において重要な役割を果たすプロテインキナーゼは、タンパク質のリン酸化を介してその機能を制御することにより、多様な生命現象に関与している。哺乳動物のプロテインキナーゼは500種類以上報告されており、状況に応じてその発現量、活性、細胞内局在などが制御されている。従って、細胞内プロテインキナーゼの全体像を解析することができれば、様々な生命現象や疾病の原因解明において重要な意味を持つ。
このような背景の中、我々はプロテインキナーゼを幅広く認識できるモノクローナル抗体としてマルチPK抗体を作製した。この抗体を用いることで細胞内プロテインキナーゼの発現量をプロファイルすることが可能である。これらの多くのプロテインキナーゼの活性は上流のキナーゼや自身によるリン酸化によって制御されることが知られている。そこで、リン酸化タンパク質をシフトアップバンドとして検出できるPhos-tag SDS-PAGEとマルチPK抗体を組み合わすことにより、プロテインキナーゼの発現量とそのリン酸化状態(活性化状態)をプロファイルする手法を開発した(sugiyama et al., MethodsX 2, 469-474, 2015)。
ヒト前骨髄性白血病細胞に様々なキナーゼを標的とする抗がん剤を3日間処理し、細胞内プロテインキナーゼを前述の方法で解析したところ、多数のキナーゼの発現量が変化するだけでなく、そのリン酸化状態が顕著に変動することを明らかとした。このうち、Vandetanibという抗がん剤を処理し、最も顕著にリン酸化状態が変動していたキナーゼがSykであることを見出した。これらのことから、本手法は、マルチ標的型の抗がん剤の主標的を見出せるだけでなく、細胞内プロテインキナーゼの動態を解析する上で非常に有効な手法であることが示唆される。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の基盤となる、マルチPK抗体とPhos-tag SDS-PAGEを組み合わせた細胞内プロテインキナーゼの動態解析法を確立し、2015年に学術雑誌MethodsXにて報告した。加えて、本手法を用いた、抗がん剤の標的解析についても併せて報告した。そのため、本研究課題はおおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

今回報告した手法では一次元の電気泳動を活用した方法を報告している。しかしながら、一次元の電気泳動では多数のバンドのリン酸化シフトを同時に検出してしまうため、どのバンドがシフトアップしているか判断がつかないという問題点が生じる。そのため、一次元目に等電点分離を行う手法を用いた二次元電気泳動法を用いた解析を進めることで、この問題の解決できると考えた。そのため、今後は本手法の発展型として二次元電気泳動を用いた解析法を開発していく。

次年度使用額が生じた理由

旅費として申請していた予算が、学会先の関係で出費が抑えられたため。

次年度使用額の使用計画

次年度に必要である細胞培養関連試薬や生化学実験試薬などの物品費に計上する。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 4件、 謝辞記載あり 4件) 学会発表 (9件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Expression analyses of splice variants of zebrafish cyclin-dependent kinase-like 5 and its substrate, amphiphysin 12016

    • 著者名/発表者名
      Syouichi Katayama, Yukako Senga, Ami Oi, Yosuke Miki, Yasunori Sugiyama, Noriyuki Sueyoshi, Isamu Kameshita
    • 雑誌名

      Gene

      巻: 583 ページ: 15-23

    • DOI

      10.1016/j.gene.2016.02.036

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Overexpression of NF90-NF45 represses myogenic microRNA biogenesis, developing skeletal muscle atrophy and centronuclear muscle fibers2015

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Todaka, Takuma Higuchi, Ken-ichi Yagyu, Yasunori Sugiyama, Fumika Yamaguchi, Keiko Morisawa, Masafumi Ono, Atsuki Fukushima, Masayuki Tsuda, Taketoshi Taniguchi, Shuji Sakamoto
    • 雑誌名

      Molecular and Cellular Biology

      巻: 35 ページ: 2295-2308

    • DOI

      10.1128/MCB.01297-14

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations2015

    • 著者名/発表者名
      Naohiro Kon, Yasunori Sugiyama, Hikari Yoshitane, Isamu Kameshita, Yoshitaka Fukada
    • 雑誌名

      Communicative & Integrative Biology

      巻: 8 ページ: e982405

    • DOI

      10.4161/19420889.2014.982405

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] マルチPK抗体とPhos-tagを利用した細胞内リン酸化動態の新規解析法2015

    • 著者名/発表者名
      杉山 康憲、亀下 勇、坂本 修士
    • 雑誌名

      生物物理化学

      巻: 59 ページ: 82-84

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Expression and phosphorylation state analysis of intracellular protein kinases using Multi-PK antibody and Phos-tag SDS-PAGE2015

    • 著者名/発表者名
      Yasunori Sugiyama, Syouichi Katayama, Isamu Kameshita, Keiko Morisawa, Takuma Higuchi, Hiroshi Todaka, Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Tohru Koike, Taketoshi Taniguchi, Shuji Sakamoto
    • 雑誌名

      MethodsX

      巻: 2 ページ: 469-474

    • DOI

      10.1016/j.mex.2015.11.007

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] 膵臓における二本鎖RNA結合タンパク質NF90及びNF45の機能解析2015

    • 著者名/発表者名
      Lai Sylvia Chin See, 樋口 琢磨、杉山 康憲、森澤 啓子、戸髙 寛、三輪 武司、津田 雅之、坂本 修士
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [学会発表] 担子菌Coprinopsis cinereaの成長菌糸に存在するCaMキナーゼ(CoPK02)の性質2015

    • 著者名/発表者名
      山下 雅史、片山 将一、千賀 由佳子、杉山 康憲、末吉 紀行、亀下 勇
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [学会発表] 抗がん剤を処理したヒト白血病細胞HL-60の細胞内キナーゼの発現およびリン酸化動態の解析2015

    • 著者名/発表者名
      杉山 康憲、片山 将一、亀下 勇、森澤 啓子、樋口 琢磨、戸髙 寛、木下 英司、木下 恵美子、小池 透、坂本 修士
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [学会発表] Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A(DYRK1A)によるCyclin-dependent kinase-like 5(CDKL5)のリン酸化とその意義2015

    • 著者名/発表者名
      大井 愛海、片山 将一、三木 洋祐、波多野 直哉、杉山 康憲、末吉 紀行、亀下 勇
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [学会発表] Ca2+/CaM-dependent protein kinase I (CaMKI) によるDistal-less homeobox 1 (Dlx1) のリン酸化とオステオカルシンの転写制御2015

    • 著者名/発表者名
      秋月 一駿、千賀 由佳子、杉山 康憲、亀下 勇、末吉 紀行
    • 学会等名
      BMB2015
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [学会発表] マルチPK抗体とPhos-tagを利用した細胞内リン酸化動態の新規解析法2015

    • 著者名/発表者名
      杉山 康憲、亀下 勇、坂本 修士
    • 学会等名
      第66回日本電気泳動学会総会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2015-09-04 – 2015-09-05
    • 招待講演
  • [学会発表] Multi-PTK Antibody: A Powerful Tool to Detect a Wide Variety of Protein Tyrosine Kinases (PTKs)2015

    • 著者名/発表者名
      Isamu Kameshita, Noriyuki Sueyoshi, Yasunori Sugiyama
    • 学会等名
      The 29th Annual Symposium of The Protein Society
    • 発表場所
      スペイン、バルセロナ
    • 年月日
      2015-07-22 – 2015-07-25
    • 国際学会
  • [学会発表] Rett症候群の発症に関わるCyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5)のアミノ酸変異と基質リン酸化活性2015

    • 著者名/発表者名
      大井 愛海、片山 将一、杉山 康憲、末吉 紀行、亀下 勇
    • 学会等名
      第56回日本生化学会中国・四国支部例会
    • 発表場所
      島根
    • 年月日
      2015-05-29 – 2015-05-30
  • [学会発表] カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIアイソフォーム(CaMKIgとCaMKIg)の自己リン酸化に着目した比較解析2015

    • 著者名/発表者名
      秋月 一駿、千賀 由佳子、杉山 康憲、亀下 勇、末吉 紀行
    • 学会等名
      第56回日本生化学会中国・四国支部例会
    • 発表場所
      島根
    • 年月日
      2015-05-29 – 2015-05-30

URL: 

公開日: 2017-01-06  

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