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2015 年度 実績報告書

微小反応場を利用した難培養微生物のシングルセルゲノム増幅法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26820365
研究機関早稲田大学

研究代表者

細川 正人  早稲田大学, ナノ・ライフ創新研究機構, 助教 (60722981)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
キーワードシングルセル / 全ゲノム増幅 / マイクロ流体デバイス / 1細胞解析
研究実績の概要

(研究目的) 生物圏のダークマターと呼ばれる環境中の難培養微生物の実態を明らかにするため、シングルセルから完全なゲノム情報を獲得する「シングルセルゲノミクス」が潮流となりつつある。本研究では、シングルセルゲノミクスの高精度化・ハイスループット化に向け、コンタミネーションリスクと増幅バイアスの最小化を実現した全ゲノム増幅法を開発することを目的とした。
(研究方法) 微生物シングルセルまたはそのDNAをピコリットル容量の微小液滴内に網羅的に封入し、全ゲノム増幅反応を同時多並行に行うことで、シングルセルゲノムに由来するシークエンスライブラリーを迅速に構築する手法を確立する。
(研究成果) 初年度には、ピコリットル容量の均質な反応場を作製するため、液滴形成に利用するオイル組成や表面改質剤の最適化を行い、液滴サイズの均一化と作製安定性を向上した。また、シングルセルゲノム増幅反応場生成のためのデバイス設計・開発を行い、微小液滴内へのシングルセル封入とゲノム増幅の条件検討を行った。全ゲノム増幅法にはMDA法を応用し、1分子DNAからのゲノム増幅とDNA結合蛍光色素による増幅産物の検出を可能とした。本手法を用いて、シングルセル由来の大腸菌DNA断片を微小液滴に封入し増幅を行った場合では、従来法と比べて増幅バイアスとコンタミネーションリスクが大幅に抑制される。この結果、シングルセルから高いゲノムカバレッジが得られることを実証した。最終年度に、2種の液滴を融合させる技術を開発し、シングルセルの液滴への封入、溶菌、全ゲノム増幅まで一連の行程を一貫して行うシステムを構築した。本システムにより、理論的に10万個以上のシングルセルを対象として同時多並行な全ゲノム増幅が可能となった。大腸菌をモデルとして1細胞由来の増幅産物の評価を行った結果、研究実施計画にて定めたゲノムカバレッジ80%以上を達成できた。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Picoliter Droplets for Low-Bias and Contamination-Free Reactions in Single-Cell Whole Genome Amplification.2015

    • 著者名/発表者名
      Nishikawa Y, Hosokawa M, Maruyama T, Yamagishi K, Mori T, Takeyama H.
    • 雑誌名

      PLOS ONE.

      巻: 10(9) ページ: e0138733

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0138733

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Droplet microfluidics for massively parallel and accurate single-cell genome amplification2016

    • 著者名/発表者名
      Masahito Hosokawa, Nishikawa Yohei, Masato Kogawa, Haruko Takeyama
    • 学会等名
      日本化学会第96春季年会
    • 発表場所
      京都府・京田辺市・同志社大学
    • 年月日
      2016-03-27 – 2016-03-27
  • [学会発表] シングルセル解析で拓く環境微生物の遺伝子資源の利活用2016

    • 著者名/発表者名
      細川正人
    • 学会等名
      発酵と代謝研究会
    • 発表場所
      東京都・文京区・東京大学
    • 年月日
      2016-02-29 – 2016-02-29
    • 招待講演
  • [学会発表] Droplet-based cell manipulation for analyzing environmental microbes at single-cell resolution2015

    • 著者名/発表者名
      Masahito Hosokawa, Nishikawa Yohei, Haruko Takeyama
    • 学会等名
      Pacifichem2015
    • 発表場所
      Sheraton Waikiki Hotel, Hawaii, USA
    • 年月日
      2015-12-18 – 2015-12-18
    • 国際学会
  • [学会発表] 微小液滴を用いた単一細胞のハイスループットな全ゲノム増幅法の開発2015

    • 著者名/発表者名
      細川正人、西川洋平、小川雅人、竹山春子
    • 学会等名
      第67回日本生物工学会大会
    • 発表場所
      鹿児島県・鹿児島市・城山観光ホテル
    • 年月日
      2015-10-26 – 2015-10-26
  • [学会発表] 微小液滴によるシングルセルの超並列ゲノム増幅2015

    • 著者名/発表者名
      細川正人、西川洋平、小川雅人、竹山春子
    • 学会等名
      第9回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      熊本県・熊本市・熊本大学
    • 年月日
      2015-09-10 – 2015-09-10

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公開日: 2017-01-06  

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