研究課題
平成２８年度は、平成２６～２７年度に開発したCa2+依存的酵素の活性化プローブを用いて、シナプス・樹状突起におけるCa2+依存的酵素の生化学演算過程の解析を行った。【Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】新規開発したカルシニューリン活性化プローブをHEK293T細胞に発現させ、プローブタンパク質を粗精製し、in vitroでの蛍光プレートリーダーを用いたFRET測定を行った。このFRETプローブ計測において、カルモジュリン阻害剤を用いた薬理学的実験を行い、カルシニューリン活性化プローブとして用いることができることを確認した。また、シナプスおよび神経細胞内での複数の細胞内シグナルを同時にFRETプローブにより可視化するために、新規蛍光タンパク質を利用したCa2+依存的酵素活性化プローブの開発を行った。【神経細胞シナプス刺激】グルタミン酸アンケイジングによる単一シナプス刺激を用いて、神経可塑性を誘導した際のCaMKIIおよびカルシニューリンの活性の時間的・空間的プロファイルを定量的に計測し、そのプロファイルの違いを明らかにした。また、dFOMA法(dual FRET with Optical MAnipulation)を用いて同一細胞・同一シナプスにおけるCaMKIIとカルシニューリンの活性化の違いの比較を行った。これらの成果より、CaMKIIとカルシニューリンのシナプス・樹状突起における生化学演算過程をこれまでにない時空間解像度で明らかにした。
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J Neurochem.
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doi: 10.1111/jnc.14020.
