| 研究課題/領域番号 |
26830085
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| 研究機関 | 福岡歯科大学 |
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研究代表者 |
藤兼 亮輔 福岡歯科大学, 歯学部, 講師 (20581713)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ミスマッチ修復 / アポトーシス / アルキル化剤 |
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| 研究実績の概要 |
アルキル化剤に誘導されるミスマッチ修復（MMR）タンパク質依存のアポトーシスの分子機構を解明するため、アルキル化剤MNUの刺激によって形成されるミスマッチタンパク質複合体の精製を試みた。
MutSaのサブユニットにビオチンリガーゼ（BirA）を融合させた場合、損傷部位への蓄積が阻害されたため計画を変更し、MutLaのサブユニットであるMLH1にBirAを融合させた。また、MMR複合体形成の際に内在性のMLH1との競合の可能性を排除するため、CRISPR/Cas9を用いた遺伝子編集によってHeLa MR細胞のMLH1遺伝子を欠損させ、この細胞を用いてMLH1-BirA融合タンパク質を発現する株を作成した。この細胞株を用いてMLH1-BirAの挙動を精査したところ、この融合タンパク質はMNU刺激に応答して核移行し、クロマチン画分への集積が観察された。またこのBirA融合MLH1タンパク質はMLH1欠損を相補したことから細胞内でも野生型MLH1とほぼ同様に機能していると予想された。次に、この融合タンパク質発現株を用いてMNU刺激後のMMRタンパク質複合体をアフィニティー精製し、既知のMMR因子に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングによりMMR複合体の形成を観察したところ、予想されたMMR複合体が精製できていることが確認できた。さらに、この精製物をポリアクリルアミド電気泳動に供し銀染色によりタンパク質を可視化したところ、MLH1-BirA融合タンパク質依存的かつMNU刺激依存的に特異的に観察されるタンパク質が複数観察された。一方で、夾雑タンパク質が非常に多いため、質量分析にはさらなる分画または分離を必要とすることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MSH2-, MSH6-BirA融合タンパク質は核移行に異常が生じたため、計画を変更してMLH1にBirAを融合したタンパク質の発現系を構築する必要があった。また、この実験系ではMMR複合体の精製量が少なかったため、精製の効率を高める必要性があった。そこで、内在性MLH1とMLH1-BirA融合タンパク質が競合しないようにCRISPR/Cas9による遺伝子編集でMLH1欠損細胞を構築し、その細胞にMLH1-BirAを発現した株を作成した。精製した複合体には夾雑タンパク質が予想したより多く、SILAC法や２次元電気泳動などの導入によってより特異的なタンパク質解析ができる実験系を組み直している。
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| 今後の研究の推進方策 |
MLH1-BirA融合タンパク質がMMR複合体の精製に有用であることが示されたため、これを用いてアルキル化剤に応答して形成されるMMR因子複合体の質量分析、新規因子の同定を進める。これを実行するためには、より多くの精製物と、より特異的な分離分画法の確立が必要であるため、MLH1-BirA発現株の大量培養と２次元電気泳動法などによる分離を行う。また、人工基質を用いて、in vitroで形成された複合体を精製する方法の検討も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進行が予定より遅れているため、それに伴い質量分析や試薬等の購入に計上した予算が使用されなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
申請書の実験計画に従い、新規因子の同定のための質量分析、機能解析のために使用する。
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