| 研究課題/領域番号 |
26840006
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大畑 樹也 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80616459)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | X染色体の不活性化 / エピジェネティクス / 長鎖非コードRNA / 多能性細胞 / Xist |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、Xist機能付加因子及びリプログラミング因子の網羅的な同定である。胚性幹細胞（Embryonic stem cell, ESC）では、X染色体不活性化及びX染色体再活性化はXist依存的におこる。しかしながら、細胞分化に伴い、X染色体不活性化／再活性化のXist依存性は失われる。我々は独自の実験により、エピブラスト幹細胞（Epiblast stem cell, EpiSC）では、Xist依存性が失われる事を明らかにした。この事は、ESCに存在すると思われるXist機能付加因子が、EpiSCでは機能していない事を示唆している。本研究は、そのXist機能付加因子の単離・同定を目的としている。また、このスクリーニング法では、EpiSCからESCへの変換に必要な遺伝子（リプログラミング因子）の単離も可能であり、平行して行う。
本研究は、（１）Xist/Tsix発現誘導ESC/EpiSCの樹立（実験系の開発と確立）（２）ESC特異的に発現している遺伝子発現ライブラリーの構築（選別の下準備）（３）Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の単離および機能解析、の３段階に分けられる。
昨年度は、Xist/Tsix発現誘導ESCの樹立による実験系の確立を行った（第一段階）。XTTGFP/XTTGFPマウス（XTTGFP：Xistの抑制因子であるTsixの発現誘導アリル＋X染色体連鎖GFP遺伝子）とXTX/Yマウス（XTX：Xistの発現誘導アリル）を導入・交配し、その胚盤胞より2i培地を用いてXTTGFPXTX ES細胞を樹立した。その細胞のXTX 側X染色体のHprt遺伝子座にCRISPR/Cas9法を用いてmCherry遺伝子をノックインした。現在までに複数の相同組換え体が単離できており、実験は概ね順調に進展している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRISPRベクターのデザインやトランスフェクションの条件検討、複数に渡る相同組換え体の選別などに時間を費やしたものの、最終的に相同組換え体を得る事ができたので、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も計画とおりに研究を推進していく予定である。
（1）ESCからEpiSCを引いたcDNAライブラリーの作製。完全長cDNAをESC, EpiSCよりそれぞれ作製し、サブトラクション法にてESCからEpiSCの遺伝子を除いたcDNA発現ライブラリーを作製する。（2）Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の選別。前年度に作製した細胞に、ESCのcDNA発現ライブラリーを導入する。Xist機能付加因子及びリプログラミング因子が機能すれば、ドキシサイクリンの添加により細胞が赤から緑に変化する。この緑に変化した細胞をFacsにて回収し、cDNAの塩基配列より候補因子を同定し、その機能を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に購入する予定であったライブラリー作成キットを購入していなかった為。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度に繰り越された予算を用いて予定とおりライブラリー作成キットを購入する。
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