| 研究課題/領域番号 |
26840011
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
安川 武宏 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90646720)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | DNA複製因子 |
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| 研究実績の概要 |
ミトコンドリアDNAはATP合成をはじめ様々なミトコンドリアの機能にとって非常に重要である。mtDNAに起きる変異やそのコピー数の低下が様々な疾患に関わっていることが知られている。近年、哺乳動物ミトコンドリアDNA（以下、単にミトコンドリアDNAと書く）の複製に対する理解は大きく前進したが、未だに多くの不明点がある。その理由はミトコンドリアDNAの複製因子（タンパク質）や複製の活性調節因子が限られたものしか知られていないことにあると考えられる。そこで本研究は、自身のミトコンドリアDNA複製メカニズムの研究経験をふまえて、ミトコンドリアDNA複製においてその制御機構がほとんど分かっていない複製開始段階と、２通りのメカニズムが存在するラギング鎖合成という、いずれも重要な点に注目してミトコンドリアDNA複製に関与するタンパク質を探索して新規因子を同定し、ミトコンドリアDNA複製をより深く理解することを目的としている。第一年度は複製開始領域を含むミトコンドリアDNA断片や複製中のミトコンドリアDNAの複製フォーク断片（ここではあわせて複製領域と呼ぶ）をタンパク質が結合した状態で細胞から調製する系を確立するために、（１）複製領域に結合することが知られているタンパク質に免疫沈降が可能なペプチドタグを融合した融合タンパク質の発現プラスミドを構築してこれをヒト培養細胞に導入して、融合タンパク質を誘導的に発現することができる細胞を複数確立し、（２）複製領域をタンパク質-DNA複合体として維持するための固定方法の検討を行い、（３）固定後に融合タンパク質が持つペプチドタグ依存的に複製進行領域をタンパク質-DNA複合体として免疫沈降を試みた
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上で概説したとおり、ミトコンドリアDNA複製進行領域に必ず存在するミトコンドリアDNAヘリケースTwinkle（野生型、そして過剰発現するとmtDNA複製中間体が蓄積することを過去に報告している2種類の変異体 [Wanrooij et al. (2007) Nucleic Acids Res.] の計3種類）に免疫沈降を確実に行なうことができるとされているペプチドタグを付加した融合タンパク質の誘導発現系が組み込まれた培養細胞の作製を行なった。そして、3種類の融合Twinkleタンパク質が薬剤誘導的に発現すること、発現して細胞内でミトコンドリアに局在することを確認した。そして、ミトコンドリアDNAのコピー数や複製中間体の挙動も観察した。そして、付加したペプチドタグ依存的に融合Twinkleタンパク質をどれも効率よく免疫沈降できることを確認した。以上をふまえて、ミトコンドリアDNA複製進行領域をタンパク質-DNA複合体としてTwinkleを介してペプチドタグ依存的に免疫沈降をする一連の実験の条件検討を行なった。この過程で複製領域をタンパク質-DNA複合体として維持するための固定を行なうが、固定（クロスリンク）によってペプチドタグがダメージを受けてしまって後で行う免疫沈降時にペプチドタグに対する抗体の結合が非常に弱くなることが明らかになった。条件検討を重ねたが採用したペプチドタグでは固定後の免疫沈降ができなくなる、あるいは効率がかなり悪くなると判断せざるを得ない結果を得た。そこで、そのアミノ酸配列からクロスリンクによって影響を受けないと考えられる別のペプチドタグを融合したTwinkleタンパク質の発現プラスミドの作製を再度行なうことにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のように、付加したペプチドタグはクロスリンクによってダメージを受けてその後の免疫沈降がうまくワークしなくなることが実験を進めた結果明らかになったので、そのアミノ酸配列からクロスリンクの影響を受けないと予測される別のペプチドタグを付加した融合Twinkleタンパク質を誘導発現できる培養細胞の作製を行なう。細胞の作製に成功すれば、前年度に条件検討を重ねた一連の実験を遂行することで、ミトコンドリアDNA複製進行領域をタンパク質-DNA複合体としてTwinkleを介してペプチドタグ依存的に免疫沈降することを成功させたい。一連の実験が成功して実験系が確立すれば、複合体中に含まれるタンパク質を所属研究室に装備されている質量分析機器を用いて決定し、決定したタンパク質の評価・機能解析に進みたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究遂行に必要な物品購入・旅費にかかった総費用が予定よりも下回ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究を遂行するための物品費、旅費、あるいは必要となればその他の費用として使用させていただく計画である。
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| 備考 |
研究室ホームページ内に科研費の情報を記載しております。
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