| 研究課題/領域番号 |
26840011
|
|---|
| 研究機関 | 九州大学 |
|---|
研究代表者 |
安川 武宏 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90646720)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | DNA複製因子 |
|---|
| 研究実績の概要 |
細胞小器官ミトコンドリア内に存在する独自のゲノム、ミトコンドリアDNA（mtDNA）はATP合成をはじめ、様々なミトコンドリアの機能にとって非常に重要である。そして、mtDNAに生ずる変異やコピー数の低下が多くの疾患に関わっていることは広く認知されている。近年、哺乳動物mtDNAの複製メカニズムに対する我々の理解は大きく前進し、これまで考えられてきたよりもはるかに複雑な系であることが示された。この複雑さを考えると、mtDNA複製系を支えているタンパク質因子はまだ知られていないものが数多く存在すると推定される。そこで本研究は、その制御機構がほとんど分かっていない複製の開始段階と、2通りのメカニズムが存在するラギング鎖合成という、DNA複製にとっていずれも重要な機序に注目してmtDNA複製に関与するタンパク質を探索・同定し、mtDNAがいかに複製され、また、調節を受けているのかをより深く理解することを目的する。第二年度は、前年度の研究から得られた知見を元に実験系の抜本的な改善を行った。複製開始領域を含むmtDNA断片や複製中mtDNAの複製フォーク断片（ここではあわせて複製領域と呼ぶ）をタンパク質が結合した状態で細胞から調製する系を確立した。まず、複製領域に必ず結合している既知のタンパク質に免疫沈降が可能でかつ、後の固定ステップで変性しないペプチドタグを融合した融合タンパク質の発現プラスミドを構築し、これをヒト培養細胞に導入して、融合タンパク質を誘導的に発現することができる細胞を複数確立した。そして複製領域をタンパク質-DNA複合体として維持したまま調製するための固定方法の検討を行った。さらに固定後に融合タンパク質が持つペプチドタグ依存的に免疫沈降を行った。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度の報告書中の今後の研究の推進方策の欄で述べたとおり、当初の実験で使用した免疫沈降のために付加したペプチドタグは、mtDNA複製フォーク上のタンパク質を固定するためのホルムアミドによる処理（クロスリンク）のステップで変性されてしまい、免疫沈降のステップで抗体による認識/結合ができなくなることが実験から明らかになったため、クロスリンクによって変性されないであろうと予測される別のペプチドタグを付加したミトコンドリアDNAヘリケースTwinkle融合タンパク質を誘導的に発現できるようなプラスミドを構築し、そしてそれを導入したstableな細胞を新たに作製した。なお、このときTwinkleは野生型、そして過剰発現するとmtDNA複製中間体が蓄積することを過去に研究代表者らが報告している2種類の変異体 [Wanrooij et al., Nucleic Acids Res.] の計3種類を誘導発現できる細胞をそれぞれ作製した。そして、これらの細胞を用いて一連の条件検討と免疫沈降実験を行ったところ、野生型、変異型Twinkleは細胞内でミトコンドリアへ局在し、どの細胞株でも十分な効率で免疫沈降ができることを確認することができた。
哺乳動物mtDNAには２つの複製メカニズムが存在することが研究代表者が深く関わってきたこれまでの研究によって強く示唆されていた。また、そのうち一方の複製メカニズムにおける複製開始ステップは、長く知られてきたmtDNA複製開始ステップとは異なっているであろうことが予想されていた。我々はこの点を詳細に検証してこの考えを支持する結果を得、同時に、mtDNA複製開始ステップで働く未知のタンパク質の存在を示唆する結果を得ることができた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
新しく作製した融合Twinkleタンパク質を用いた場合、クロスリンク処理後も効率よく免疫沈降ができることが確認できたので、今後は免疫沈降の条件をはじめ、細胞の培養条件やクロスリンク処理条件等のさらなる最適化を行う。そして、所属研究室に装備されている質量分析機器を駆使して免疫沈降物に含まれるタンパク質を同定したいと考えている。また、野生型Twinkle発現細胞から比べて、変異型Twinkle発現細胞で生ずるmtDNA複製中間体の変化を利用して、mtDNA複製の二つのメカニズムの一方に特異的なタンパク質因子の同定を試みる。そして、同定したタンパク質が具体的にどのような役割をmtDNAの複製に果たしているのかを、そのタンパク質を過剰発現、またはRNA interferenceによる発現抑制を行ったとき、mtDNAコピー数やmtDNA複製中間体に現れる変化を詳細に観察することから明らかにしていきたいと考えている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究遂行に必要な物品購入・旅費にかかった費用が予定よりも下回ったためです。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
研究を滞りなく進めるために、物品費、旅費、または、必要が認められればその他の費用として使用させていただく計画です。
|
