| 研究課題/領域番号 |
26840033
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
檜作 洋平 京都大学, ウイルス研究所, 助教 (70568930)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | サルモネラ菌 / 酸性ストレス応答 / GFP / 一細胞リアルタイム観察 / 蛍光イメージング / 生物物理学 / 生化学 |
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| 研究実績の概要 |
本年度の主な研究成果は以下の通りである。項目は研究実施計画と対応してある。
【1】 新たなσE活性化経路の探索
(1) DegS非依存的な新規σE活性化ストレスの網羅的探索と解析： ■今年度は大きな進展はなかった。(2) サルモネラ菌を用いたDegS非依存的σE活性化ストレス応答の解析： ■先行研究で報告された酸性ストレス添加によるストレス応答（Muller et al., 2009）の再現を試みた。サルモネラ菌を用いて様々な培養条件や背景株、発現系を検討し、特定の条件下で酸性ストレス添加を行った時にDegS非依存的に全長RseAの切断が起きることを定量化により示した。
【2】 蛍光観察による表層ストレス応答システムの膜ダイナミクス解析
■大腸菌において蛍光顕微鏡観察系の確立を試みた。RseP及びRseAに緑色蛍光タンパク質EGFPを融合させた蛍光融合体をいくつか作製し、分解が少なく安定で蛍光強度の強い蛍光顕微鏡観察に適した融合体を得た。RseP-GFP融合体はモデル基質の切断能を有していた。作製した融合体は細胞膜上に蛍光局在した。またEGFPよりも蛍光効率の良い改変体であるmsfGFP（monomeric super-folder GFP）を導入し、より効率よく蛍光を発するGFP-RseA融合体を取得した。■rseP欠失株中でGFP-RseA融合体を発現させ、そこにRsePを発現誘導させたところ、時間経過とともに細胞膜上に蛍光局在を示す菌体の割合が減少し、細胞質内に蛍光局在を示す菌体が増加することを示した。さらに、アガーで作製したパッド上に菌体を固定し、同一の菌体をタイムラプスで長時間観察したところ、RsePの発現誘導に依存して細胞膜上から細胞質内へ蛍光局在シフトしていく様子を観察した。これはRsePによるRseAの膜内切断反応を一細胞でリアルタイム観察した初の例である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は項目【2】 蛍光観察による表層ストレス応答システムの膜ダイナミクス解析 に重点を置いて研究を進めた。その結果RseP及びRseAの蛍光顕微鏡観察系の確立を達成し、さらにRsePによるGFP-RseA蛍光融合体の切断に伴う蛍光局在シフトを一細胞でリアルタイムに観察することが可能になった。これは表層ストレス応答のダイナミクス解析に向けて大きく前進するものである。また、予備的にではあるがストレス添加に応じた蛍光局在変化も検討を始めている。これは平成27年度の研究実施計画に含まれる内容であり、計画を前倒しして実施していることになる。項目【1】 新たなσE活性化経路の探索 に関してもサルモネラ菌を用いた酸性ストレス応答解析を進め、これまで研究室にはなかった実験系を立ち上げつつある。以上の観点から、ここまでの研究計画はおおむね順調に進展していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
【1】‐(1)に関しては大きな進展がないので、当初の研究計画に則り進める。■i) phenotype array解析によりσE活性化ストレスのスクリーニングを行う。■ii) ASKA Library導入により網羅的スクリーニングを行う。(A), (B)の解析から得られたストレス候補がRseP PDZに依存するかを、染色体上rseP遺伝子PDZドメイン欠失株を用いて調べる。
【1】‐(2)に関してはサルモネラ菌を用いて酸性ストレス応答を評価する系が整ってきたので、この系を用いて引き続き研究計画通り解析を進める。■i) サルモネラ菌中のアッセイ系を用いて大腸菌RsePの各種変異体（PDZ-N, -C, -NC各欠失体、制御異常変異体等）を導入し、酸性ストレス応答が変化するかを調べる。
【2】の蛍光顕微鏡観察に関しては計画通り順調に進行しているので、引き続き進める。全体の中でこの項に重点を置いて進めることとする。■i) 熱ストレスやストレス誘導因子PMBNの添加といった表層ストレス添加時の蛍光局在変化を解析する。予備的に進めつつある。■ii) RseP及びRseA蛍光融合体を染色体に組み込み、生理的な発現条件・タイミングで発現誘導した時のストレス応答及び蛍光局在変化を解析する。一細胞リアルタイム観察系を用いてダイナミクス解析にも取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（物品費）：設備備品等は申請者がこれまで行ってきた表層ストレス応答研究及び蛍光顕微鏡解析を統合・発展させたものであり、研究室の保有機器及び研究所の共同利用機器を使用することで研究遂行が可能であった。消耗品等については当初予定していたサルモネラ菌用抗体作製等を見合わせたこと等により使用額が減少した。（旅費）：国内・国外学会の参加を当初予定していたよりも減らしたこと、共同研究の打ち合わせ等がまだ必要とならなかったことなどから使用額が減少した。（人件費・謝金等）：計上していた論文作成時の英文校閲費用等がまだ必要とならなかったこと等によって使用額が計上されなかった。（その他）：計上していた論文投稿料や、蛍光顕微鏡等の保有機器の修理費用等が必要とならなかったことによって使用額が減少した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
（物品費）：研究の進捗状況により、本年度に使用しなかったサルモネラ菌の抗体作製費、ストレス誘導剤の候補となる薬剤等の購入費、蛍光試薬、蛍光タンパク質発現用プラスミドの購入費等で使用する予定である。また、恒温観察用の温度制御ユニット等、蛍光顕微鏡解析の進捗によっては系の改良が必要となり、設備費として計上する必要が出てくる可能性がある。（旅費）：本年度の学会・研究会参加を控えた分、次年度は積極的に学会・研究会に参加したいと考えている。また、蛍光顕微鏡観察等で共同研究が始まれば、その打ち合わせ費用として計上する必要がある。（人件費・謝金等）：次年度の研究成果によっては論文作成に取り掛かる可能性もある。その際には英文校閲費等を計上する必要がある。（その他）：論文投稿料を見込んでおく。また保有機器の修理・維持費用等は余裕を持って計上する必要がある。
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