| 研究課題/領域番号 |
26840080
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
荒巻 敏寛 大阪大学, 生命機能研究科, 招聘研究員 (30525340)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 形態形成 / 電気シグナル / 光遺伝学 |
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| 研究実績の概要 |
（１）ゼブラフィッシュ模様形成における電気シグナルの機能解析
平成２６年度には、光による模様の人為的操作技術の確立を目的とし、色素細胞にチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ作成を試みた。色素細胞に野性型のチャネルロドプシンを発現させた場合には、青色光照射により模様の変化を誘導することができたが、その変化の程度は小さいものであった。そこで、より大きな変化を誘導するため、チャネル開口時間の長い改変型チャネルロドプシンを利用することを考案した。チャネルの開口時間が長くなると、より多くのイオン流動が生じるため膜電位の変化も大きくなると考えられる。実際に、色素細胞に改変型チャネルロドプシンを発現させると、通常飼育条件での低い光量でも模様の変化が生じるようになった。このトランスジェニックゼブラフィッシュは暗条件下で飼育すると模様の変化をほとんど生じず、また、青色光照射条件で飼育することにより模様の変化は更に促進された。
（２）発生過程における電気シグナルの機能スクリーニング
上記（１）で、模様形成において大きな効果を示した改変型チャネルロドプシンを用い、胚発生期に電気シグナルを撹乱することで形態的な異常が生じることを確かめる実験を行った。in vitro合成した改変型チャネルロドプシンmRNAを１細胞期胚に微小注入し、青色光照射下で発生させたところ、注入胚、非注入胚共に孵化前に死亡した。今回実験に用いた強度の青色光は、チャネルロドプシンを発現していない胚においても致命的な発生異常を引き起こす副作用があると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（１）ゼブラフィッシュ模様形成における電気シグナルの機能解析
当項目に関しては、平成２６年度の計画目標は概ね達成できていると思われる。当該年度中に、光照射依存的に模様が変化するゼブラフィッシュを作成することができた。十分にチャネルロドプシンの機能を発揮させるためには高い発現量が必要であると予測していたが、より活性の高い改変型チャネルロドプシンを利用することによりこの目的を達成できた。また、この改変型チャネルロドプシンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは想定していたよりも低い光強度（通常飼育下）においても模様の変化を示し、青色光照射により更に変化が促進された。このことから照射する光の強度を変えることにより、異なる模様を人為的に創出できる可能性が示唆される。
（２）発生過程における電気シグナルの機能スクリーニング
当項目に関しては、進展に若干の遅れが生じている。発生期における高強度の青色光照射自体が、胚に致命的な影響を及ぼすことは予測していなかった。胚発生に影響を与えない程度に光条件の調整を行うか、あるいは青色光を使用せずに細胞の膜電位を変化させる方法を検討する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）ゼブラフィッシュ模様形成における電気シグナルの機能解析
平成２７年度の研究では、２６年度に作成した改変型チャネルロドプシンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを用い、光強度、明滅パターンなどの照射条件を変えることにより様々な模様を人為的に創出することを試みる。また、先行研究からゼブラフィッシュの縞模様の形成には「反応拡散モデル」の原理が働いていることが示唆されており、任意に操作した色素細胞の膜電位変化パターンと、結果生じる模様との関連性が反応拡散モデルにより説明できるかどうかを検証する。また、昨年クロライドイオン透過型チャネルロドプシン（ChloC）が開発された（Wietek, Science, 2014）。ChloCは通常のチャネルロドプシンとは逆に、光照射により発現細胞を過分極させる。これを利用して、過分極方向への膜電位変化と模様の関連についても解析を行うことを計画している。
（２）発生過程における電気シグナルの機能スクリーニング
胚発生期における青色光の毒性を回避するための検討を行う。まずは現在使用している改変型チャネルロドプシンを用いて、胚発生に与える影響が小さく、且つ十分に膜電位変化を誘導できる適切な光条件を探索する。また、上記のような適切な光条件が得られなかった場合を考え、代替手段として光刺激を必要としない膜電位撹乱手法の検討を行っておく。現時点での候補としては、異常に伸長した鰭を持つanother-long-fin変異体の原因遺伝子として特定されたカリウムチャネル（kcnk5b）を利用することを計画している。変異型kcnk5bタンパク質は恒常的に開いたカリウムチャネルを構成し、発現細胞を過分極させる。この特性は本研究において、胚細胞の膜電位の撹乱に利用できると考えた。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画では、トランスジェニックゼブラフィッシュに光照射を行いながら飼育するために大規模な水槽システムを作成する予定にしていた。しかしながら、各水槽ごとに様々に光照射条件を変更して検討することを考慮し、実際の実験では各水槽ごとに個別に光照射する小規模なシステムを採用した。これは各水槽ごとに独立したコンパクトなシステムであり、所属研究室に既存のインキュベーター等を流用することができたため、平成２６年度では大きな機材を購入する必要もなく実験を進めることができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２７年度では、実際に様々な光照射条件においてトランスジェニックゼブラフィッシュを飼育する計画である。そのためには、現在使用している各水槽ごとに独立した光照射システムが多数必要になる。次年度使用額は、多数の小型光照射水槽システムの構築費用、ならびにそれらを格納するためのインキュベーターの購入費用として使用する予定である。
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