| 研究課題/領域番号 |
26840101
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
今井 章裕 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, NIBBリサーチフェロー (40711198)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | オーキシン / 幹細胞 / 発光イメージング / 低分子RNA / ヒメツリガネゴケ |
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| 研究実績の概要 |
ヒメツリガネゴケ新型発光オーキシンセンサーラインの作成にむけて、ヒカリコメツキムシ由来の緑色型および赤色型ルシフェラーゼがヒメツリガネゴケの細胞内において発光活性をもつか調べた。各遺伝子を発現する形質転換体がそれぞれ緑色あるいは赤色の発光をもつことを、発光検出顕微鏡装置を用いることによって確認した。同時に、オーキシンセンサー上で両遺伝子配列を介在する手足口病ウイルス由来の自己切断配列2Aがヒメツリガネゴケにおいて機能することを、ウエスタンブロット解析によって確認した。オーキシンセンサーを誘導する恒常的プロモーターとして、EF1α遺伝子のプロモーターと、エストロジェン誘導性GX8プロモーターを比較した結果、その活性の強さからGX8を採用することに決めた。これらの予備実験を経て、新型発光オーキシンセンサー用プラスミドの構築を行い、ヒメツリガネゴケへの形質転換を完了した。当ラインのオーキシン応答性を評価するため、現在オーキシンおよびアンチオーキシンを添加した際の発光シグナルの変化を調べている。
低分子RNAであるmiR1219の過剰蓄積によって、標的遺伝子であるARF11の転写産物量の低下と、幹細胞化の遅延が引き起こされるという予備的な実験結果が得られた。これはmiR1219が、ARF11を介して幹細胞化を負に制御する可能性を示す結果である。並行して、miR1219およびARF11を制御する別の低分子RNAであるtasi-ARFの蓄積を可視化できる低分子RNAセンサーラインを作成した。
推定オーキシン輸送タンパク質であるPpPIN1, PpPIN2, およびPpPIN3タンパク質の局在について、既存であった蛍光タンパク質融合遺伝子ノックインラインを用いて観察し、PpPIN2とPpPIN3が葉細胞の細胞膜に局在していることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新型発光オーキシンセンサーラインに関しては、ヒメツリガネゴケにおける発光タンパク質および自己切断配列の活性確認、誘導プロモーターの選定、といった予備実験を終え、当初計画していたセンサーラインの作成を完了することができた。当ラインが実際にオーキシンに応答するかを評価するアッセイ方法の検討に予定外に時間を費やしているものの、方法が定まり次第、速やかにオーキシン応答性の評価へとすすめられると考えている。
低分子RNAに関しては、miR1219の幹細胞化への関与を示唆する結果が得られ、低分子RNAセンサーラインの作成も計画どおりにすすんだ。
推定オーキシン輸送タンパク質であるPpPINsの通常発生時における細胞内局在の解析も完了した。
プラスミドの作成、形質転換実験、形質転換体のスクリーニング、顕微鏡を用いた観察実験など、問題なく実行できており、おおむね計画通りに進行していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
新型発光オーキシンセンサーのオーキシン応答性の評価を行う。ラインの有用性が確認されれば、切断葉の平面的な細胞配置を考慮に入れながら、幹細胞および非幹細胞を区別してシグナルの動態を定量的に計測する。この実験では多数のサンプルを解析する必要があるため、解析プログラムの導入あるいは作成を検討する。
miR1219の幹細胞化への関与を確認するため、過剰蓄積ラインにおけるARF11の発現解析と幹細胞化表現型解析を行う。また、解析に使用する低分子RNAセンサーラインの選抜が完了次第、標的配列内に変異を導入したラインと比較しながら、切断葉におけるtasi-ARFとmiR1219の時空間発現動態を調べる。ARF11のプロモーター活性および転写産物の蓄積パターンと照合し、低分子RNAによるARF11の制御モデルを提唱する。
オーキシン生合成制御遺伝子およびオーキシン輸送タンパク質遺伝子のノックインラインの作成と整備を完了し、各々の幹細胞過程におけるタンパク質局在の変動を定量的に調べる。
赤外線レーザー照射誘導遺伝子発現システムであるIR-LEGOを用いて、ARF11、低分子RNA、オーキシン生合成制御遺伝子らの発現修飾を行う。これらの発現修飾用プラスミドを形質転換する親株としては、新型発光オーキシンセンサーラインを用いる。
以上の実験結果を基に、幹細胞および非幹細胞におけるARF11シグナリングネットワークの時空間変動をシミュレーション解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度中に開始あるいは完了する予定であった、新型オーキシンセンサーおよび低分子RNAセンサーのタイムラプス定量解析とmiR1210過剰蓄積ラインの遺伝子発現解析が、実験の進行が遅れたため、次年度に行う見込みとなった。顕微鏡周辺機器の部品の購入に要する経費と、遺伝子発現解析に必要な試薬の購入に要する経費を、実験の進行状況に合わせ、次年度に繰り越すことにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
タイムラプス解析に必要である顕微鏡周辺機器の部品、画像解析用PC周辺機器、プラスミド構築や形質転換体の選抜に必要な試薬類、遺伝子発現解析試薬を購入する。顕微鏡を用いた解析および植物体の培養を効率化するため、これらの実験を専門とする技術支援員を雇用し、謝金として使用する。また、学会等への参加に必要な旅費として使用する。
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