| 研究課題/領域番号 |
26840111
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
神田 真司 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (50634284)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | キスペプチン / イソトシン / バソトシン / カルシウムイメージング |
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| 研究実績の概要 |
キスペプチン神経系とイソトシンバソトシン神経系の関係性の解析を行うため、形態学的解析、電気生理学的解析に加えてカルシウムイメージングを開始している。バソトシン遺伝子のエンハンサーを用いて発現させた組み替えタンパク質のカルシウムインジケーターは、蛍光が弱く、解析が困難なため、共同研究者より供与されたvasotocin-EGFPトランスジェニックメダカにFura-2をＡＭ体で導入する方法を用いることにした。そうしたところ、カルシウムイメージングが細胞体レベルで効率的に行えるようになった。その結果、電気生理学的な解析と同様に、キスペプチンに対する応答がバソトシンニューロンで見られることがわかった。また、この実験系を用いて、他の神経伝達物質に対する応答も解析中である。
一方で、脳下垂体バソトシン放出末端におけるキスペプチン制御の解析を行うためには、線維でのカルシウムイメージングが不可欠であり、この解析には、細胞体から順行性にカルシウムインジケーターを導入する、あるいは遺伝的にカルシウムインジケーターを組み込んだ個体でのイメージングが必要となる。今後カルシウムイメージングの検出系の改善、あるいは導入方法の変更によってこの問題を解決する必要がある。
イソトシンバソトシンニューロン以外のニューロンについても、キスペプチン受容体を発現するニューロンをＧＦＰで可視化した個体の電気生理学的、形態学的な解析によって進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
電気生理学的手法に加え、カルシウムイメージングでキスペプチンの作用をアッセイできるようになったことから、複数のニューロンをまとめて、高効率に解析できるようになった。一方で、間接作用を観察するためには、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを使い、放出末端でのイメージングを行うことを考えているが、こちらはカルシウムインジケーターの強度の問題で、現在のところうまく行っていない。この問題の解決には、蛍光の検出系を強化することが最も簡便な方法だと考え、年度末より検討している。かなりの改善が見られたため、この実験系で再度遺伝的にコードされたかるしむインジケーターをい用いた放出末端のイメージングに挑戦する予定である。
TALEN法を用いて作成したノックアウトメダカの解析も、様々な機能を持つ可能性を含めて研究遂行中であり、明らかになってくるフェノタイプを元に、イソトシン・バソトシン神経系の機能が明らかになる。それにより、キスペプチン神経系による制御の意義がわかってくると考えられる。
キスペプチン神経系によるバソトシンニューロンの活動制御に加え、キスペプチン神経系自体の解析も進めている。あたらしく作成した抗体を用いて、キンギョとメダカの異なる局在を示すキスペプチンニューロンの投射解析を行っている。この免疫組織化学的解析により、従来より行ってきた形態学的証明である受容体の共発現に加え、実際にキスペプチンニューロンがバソトシンニューロンに直接投射していることが強く示唆された。また、この投射解析は、ステロイド感受性の有無も含めたキスペプチン神経系の脊椎動物を通じた機能の理解の一助になることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究で明らかになったキスペプチン神経系のバソトシンニューロンに対する作用を、形態学的、生理学的に、より詳細なメカニズムを検討してまとめる作業を進める。また、ノックアウトの解析から明らかになりつつあるバソトシン、イソトシンニューロンの機能をより詳細に解析することにより、脊椎動物の誕生から保存されてきたバソトシンノックアウトメダカの解析を進める。この解析には、ノックアウト動物、トランスジェニック動物を活用し、生理学的、形態学的に行おうと考えている。予定通り、現在樹立しつつあるキスペプチンノックアウトメダカとバソトシンノックアウトメダカの表現型を比較することにより、その相関関係について解析していく。
一方、キスペプチンは哺乳類においては生殖調節において必須な、大きな役割を持っているという考え方が固まりつつあるが、他の系統についてはほぼ否定的な結果が多い。そこで、キスペプチンニューロンに関しては、受容体を発現するニューロンを可視化したトランスジェニックを活用し、脊椎動物に広く保存されているキスペプチンの機能を理解すると共に、何故キスペプチンニューロンが哺乳類において突然生殖調節機能を持つようになったのか、という進化の謎を解決するため、本年度作成した抗体や、従来より用いているトランスジェニック、in situ hybridizationを活用した形態学的な解析を中心にヒントを得ていきたい。
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