| 研究課題/領域番号 |
26840114
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
赤松 由布子 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (50381661)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | リボソームRNA遺伝子 / DNA複製 / 転写 / ゲノム不安定性 |
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| 研究実績の概要 |
複製と転写は、両者ともゲノムDNAを鋳型として新生DNA鎖または新生RNA鎖を合成する。しかしS期に発現している遺伝子領域において、転写中のゲノムDNAがどのように複製されるのかについてはあまり理解されていない。
本研究では、ヒトゲノムに約400コピー存在し、細胞内で最も転写の活発なリボソームRNA(rRNA)遺伝子(rDNA)に着目しDNA複製を解析した。
平成26年度は、DNA複製中間体の構造を分離することが出来るDNA二次元電気泳動法を利用して、rDNAの複製をS期の進行に伴って解析した。rDNAの45S rRNAコーディング領域3’側には、Replication fork barrier(RFB)と呼ばれる複製フォーク進行阻害点が存在し、RNA polymerase I(PolI)転写複合体とDNA複製複合体の衝突を回避すると考えられている。この領域を含むDNA複製中間体を調べたところ、RFBの複製阻害活性はS期初期に最も高く、S期後期ではDNA複製が阻害されること無く45S rRNAコーディング領域に侵入することが分かった。rDNAでは転写の活発なコピーはS期初期に転写の起こらないサイレントなコピーはS期後期に複製されることが分かっており、この結果はRFB活性と転写活性の連携を示唆している。さらに、CpGメチル化感受性制限酵素を用いた複製中間体の解析から、CpGメチル化が起こっているrDNAコピーでは複製フォークの進行阻害が起こらないことが明らかになった。したがって、エピジェネティックな機構によるRFBの活性制御の存在が示唆された。
また、rDNAに存在するRFBの制御配列を決定するために、ヒト細胞中でDNA複製可能なプラスミド上に45S rRNAコーディング領域3’側を含むDNA断片を単離し、RFBをプラスミド上に再構築した。この解析から、この領域に複数存在するPolI転写終結エレメントSal-boxのうち、特にSal-box T1とT4/T5がRFBのcisエレメントとして機能することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトゲノムに約400コピーがコードされるrDNAは、全てが転写活性化されるわけではなく、エピジェネティクスに異なる状態で存在し、転写活性のあるアクティブなrDNAコピーとヘテロクロマチン化された転写が不活性なサイレントなrDNAコピーに分かれる。平成26年度は、これらのエピジェネティクスが異なるrDNAコピー間でDNA複製に差異が見られる領域を見いだすことを予定していたが、45S rRNAコーディング領域3’端に存在するRFBの活性がその領域であることを発見した。この結果から、今後の研究の糸口を得た。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度の研究結果をもとに、RFBにおけるDNA複製フォーク進行阻害が、PolI転写装置との衝突を回避するために重要であることを実験的に証明し、RFBの役割を確立する。さらに、ヒト細胞内でDNA複製するプラスミド上にRFBとPolI転写を再構築して解析を行い、RFBとPolI転写活性の関係性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度は論文を投稿したので掲載費用の支出を見込んだが、出版が次年度に遅れたため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本研究では、必要な機器類は既にあるものを使うことが出来るので、主に実験に必要な物品類を購入する。また、研究発表のための学会参加費用と論文掲載費用を見込む。
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