| 研究課題/領域番号 |
26840117
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
西原 秀典 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (10450727)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 分子進化 / 発現制御 / 脳 / 哺乳類 / レトロポゾン |
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| 研究実績の概要 |
レトロポゾンに由来するAS021配列は、脳梁投射ニューロンにおいてSatb2遺伝子のエンハンサーである。このエンハンサーが真獣類特有の脳梁の形成にどのように寄与しているのかを明らかにするため、今年度は次の３点に関して研究を進めてきた。（１）AS021配列とlacZレポーター遺伝子を導入した組み換えマウスを用い、出生直後 (P0)の終脳における発現解析をおこなった。beta-Gal、Satb2、およびAS021結合因子の抗体を用いた免疫染色をおこなった結果、大脳新皮質の深層および中間体において、結合タンパク質とLacZの発現が逆相関の関係にあることが分かった。当初はAS021配列の結合因子として単離されたタンパク質はエンハンサーの活性化因子として機能すると予想していたが、本実験結果はこのタンパク質が抑制的に働く可能性があることを意味している。（２）AS021配列を欠損させたノックアウトマウスを用い、発現解析をおこなった。上記と同様の抗体、およびSatb2の抑制対象であるCtip2の抗体を用いた免疫染色によって発現パターンの比較をおこなってきたが、現在までに野生型マウスと比較して関連遺伝子の発現パターンに大きな違いは発見できていない。これについては今後さらなる個体の解析を進め、他の発生ステージの解析も検討する必要があると考えられる。（３）レトロポゾン由来のエンハンサーを多数探索することを目的として、Neuro-2aなど神経由来培養細胞を用いたChIPアッセイを試みてきた。しかし現在までに十分な実験系の確立には至っておらず、用いる抗体の検討などさらなる試行が必要と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
３項目の研究内容のうち、（１）AS021-lacZを用いた免疫染色は予定通り進んでおり、AS021エンハンサーの結合因子の機能に関して予想外の発見が得られた。これはレトロポゾン由来のシス調節配列の機能解析を進める上で非常に重要な知見となる。（２）ノックアウトマウスの解析を前倒しして開始しており、未だ野生個体との大きな差異は発見できていないものの、研究計画としては当初の予定よりも大幅に進展していると言える。（３）一方でChIPアッセイについては実験を開始しているものの実験系を確立する上での問題を克服するのに時間を要しており、予定よりやや遅れている。これが成功すれば大きな研究の発展が期待されることから、今後急ぎ進める必要がある。
以上、全体としてはほぼ順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の方針としては、（１）まずAS021-lacZを用いた免疫染色を引き続き進める。特にP0のみならずE13.5以降の様々な発生ステージにおける免疫染色をおこない、エンハンサー活性と、Satb2やCtip2などの関連遺伝子発現の比較解析を脳梁投射ニューロンの発生過程を追って明らかにする。特にエンハンサー結合因子と比較した発現パターンの推移に注目して比較する。（２）ノックアウトマウスについては、脳梁形成異常の有無を詳細に調べるために幅広い発生ステージの脳組織を用いた組織染色を引き続き進める。また前年度からおこなってきた免疫染色も並行的に進め、年度内に完了させる予定である。（３）ChIPアッセイに関しては、必要であれば別の抗体を用いて多くのレトロポゾン由来のエンハンサー探索を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
神経由来の培養細胞を用いてChIPアッセイを進める予定であったが、抗体の質に問題があると考えられるために実験系の確立に時間を要している。そのためChIP実験費用として見積もられた助成金の一部を翌年度に使用することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ChIP実験系の確立は、未使用額分も使用して今年度の出来るだけ早い時期に完了する予定である。一方で他の実験は当初の計画通り又はそれ以上に進展しており、ほぼ予定通りにAS021組み換えマウスやノックアウトマウスを用いた発現解析等に使用できると見込まれる。
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