| 研究課題/領域番号 |
26850028
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
出崎 能丈 明治大学, 農学部, 助教 (80711647)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 植物免疫 / キチン / CERK1 / MAMP / PAMP |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、先行研究で同定したシロイヌナズナキチン受容体CERK1の相互作用因子であるユビキチンリガーゼAtPUB4の、キチンシグナリングにおける機能を明らかにすることを目指している。また近年、ユビキチン化を介した受容体の量的制御、局在制御の重要性が示唆されているが、我々は最近CERK1が生体内でユビキチン化修飾を受けることを明らかとしており、これに関わるユビキチンリガーゼの同定およびそのユビキチン化の意義についても解明を目指している。
まず本年度はAtPUB4の機能を明らかとするために複数アリルの変異体を用いた解析、および相同性の最も高いAtPUB2との二重変異体を用い、キチン誘導性の防御応答に与える影響を評価した。この結果、AtPUB4は活性酸素生成とカロース蓄積は正に制御し、MAPKの活性化と防御応答関連遺伝子の発現誘導は負に制御することが示唆された。今後はこれらの確認を進めるとともに、植物免疫におけるAtPUB4の役割を明らかとするために相補実験、病原菌に対する抵抗性検定、さらにはホルモンの一斉分析などを進めて行く予定である。
また、生化学的な機能解析では、CERK1からAtPUB4に対するトランスリン酸化に着目し研究を進め、in vitroでAtPUB4がCERK1によってリン酸化されることを示した。このことはCERK1がリン酸化を介してAtPUB4の機能を制御する可能性を強く示唆している。
さらに本研究では、CERK1を直接ユビキチン化する因子の同定や、そのユビキチン化による制御を明らかとするために、候補となるユビキチンリガーゼ変異体でのCERK1のユビキチン化や分解、さらにはその細胞内動態を解析することを目指している。本年度はこれら解析に必要となる抗体や各種形質転換体の作出といった準備を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究実施計画に基づき研究を進め、おおむね期待通りの結果を得ている。
変異体を用いた生物学的機能評価においては、植物免疫シグナル伝達系におけるAtPUB4の機能を示唆するデータが蓄積されている。また今後の解析に必要となる相補個体や各種形質転換体の準備状況も順調に進んでいる。また変異体における表現型を理解するために、当初の計画にはなかったホルモンの一斉分析を行うこととし、この準備も進んでいる。
生化学的な機能評価においてはCERK1からのAtPUB4へのトランスリン酸化が確認された。タンパク質の精製法などはこの過程ですでに準備が済んでおり、早期にリン酸化AtPUB4の精製を行い、質量分析によってリン酸化部位の同定が進められる状態にある。
CERK1のユビキチン化を行うユビキチンリガーゼの同定や、ユビキチン化CERK1の動態解析の準備も順調に進展しており、2年目以降にその解析が進むことが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の施計画に基づき研究を遂行する。
まず、現在作出している相補個体を用い、これまで見られてきたatpub4変異体の表現型が実際にAtPUB4に起因することを確認する。また、ホルモンの一斉分析、抵抗性検定に関しては早期に実行し、AtPUB4の植物免疫およびキチンシグナリングにおける役割を検討する。
CERK1によるAtPUB4のリン酸化に関しても、早期に質量分析によるリン酸化部位同定を行う。同定されたリン酸化部位に関しては、リン酸化部位をアミノ酸置換した大腸菌発現タンパク質を用い、in vitroのユビキチン化アッセイによって機能に与える影響を評価する。また、atpub4変異体を用いた相補実験系においても同様のアミノ酸置換体を発現させ、その防御応答に対する機能を検討していく。
CERK1のユビキチン化やその意義の解析に関しては、すでに必要な形質転換体などの準備が進行している。CERK1をユビキチン化する候補となるユビキチンリガーゼ変異体をバックグラウンドとしたタグ付きCERK1発現形質転換体を用いることで、生体内でCERK1をユビキチン化する因子の同定を目指す。さらに、cerk1変異体をバックグラウンドとしたタグ付きCERK1発現形質転換体を用い、キチン処理時のCERK1タンパク質の増減および付加されるユビキチン鎖の種類を明らかとしていく。またGFPなどの蛍光タンパク質を付加したCERK1形質転換体を用いることで細胞内での動態解析を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
これまでのところ既存の実験系を効率的に利用ができた為、想定よりも新規の試薬や消耗品の購入額が少なくなった。
また、AtPUB4抗体の作製に関しては想定以上に力価の強い抗体を得ることができたため、計画上予定していたタグ付きタンパク質の検出が最小限となり、それに対する抗体の購入を控えることができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
初年度の研究では、以降の研究で用いる予定の各種形質転換体の作出や、CERK1からAtPUB4へのトランスリン酸化解析系、AtPUB4のin vitroユビキチン化実験系およびシロイヌナズナ生体内でのユビキチン化検出系などの実験系の構築が順調に進展している。
今後はこれらの各種形質転換個体や実験系を組み合わせて前述した生物学的評価や生化学的評価が進行することが期待される。特に生化学実験ではユビキチンアッセイ系の試薬やユビキチン抗体、さらにはユビキチン化、膜輸送に関わる阻害剤など高額な試薬を用いる必要が出てくるため、予算はこれらの購入に充てる予定である。
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