| 研究課題/領域番号 |
26850041
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
園木 和典 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (20502264)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | プロトカテク酸脱炭酸酵素 / ムコン酸 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、脱炭酸活性が向上したプロトカテク酸脱炭酸酵素（Pdc）について活性向上のメカニズムを明らかにし、高活性化Pdcと多様なリグニン系芳香族化合物を分解できるP. putida KT2440株の代謝系を利用して、リグニン系芳香族化合物を原料としたccMA生産に資する微生物株を育種するために、（1）脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価と、（2）高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価について、H26年度の計画を実施した。
（1）脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価：Pdc活性を向上させる遺伝子領域を検討した結果、Phenolic acid decarboxylase（BsdBCD）を構成する3つのサブユニットのうちBsdBと相同性を有する遺伝子（kpdB；4-hydroxybenzoate decarboxylase (KpdBCD) のサブユニットをコードする遺伝子）がPdc活性の向上に必須の領域であり、PdcとKpdBを発現する組換え大腸菌由来の粗酵素液中のPdc活性は、10倍以上向上することを明らかにした。粗酵素液中のPdc活性の最適pHは5.5、最適温度は35℃であった。この高活性化Pdcを生産する組換え大腸菌の粗酵素液からPdcの精製を試みたが、これまでに報告されてきたPdc同様、粗精製の段階でPdc活性の顕著な失活が確認された。また、DEAEクロマトグラフィーにおいてPdcとKpdBは異なる画分に分画され（異なる塩濃度で溶出され）たことから、PdcとKpdBは複合体を形成しておらず、他のメカニズムによってPdc活性が向上していることが示唆された。
（2）高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価：P. putida KT2440株のニトロソグアニジン変異株の中から、PAを代謝できない変異株を選択し、さらにcatBを破壊して、PAだけでなくccMAも代謝できない変異株を作出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価
精製過程においてPdc活性の急激な失活が観察されたので、当初計画の対応通り、粗酵素液を用いて高活性化Pdcの評価を達成した。しかし十分な活性を保持した状態で高活性化Pdcの精製には至らなかったので、構造解析は保留した。
(2)高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価
当初計画の通り、PAとccMAを代謝できない変異株の作出を達成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)脱炭酸活性が向上した高活性化Pdcの生化学的諸性質の評価
当初計画通り、引き続き高活性化Pdc反応の諸性質解析を進める。特に精製酵素を調製して反応機構を解明を進める。26年度の取り組みにおいて、高活性化Pdcを発現する大腸菌粗酵素液は、4℃で24時間経過しても80％以上のPdc活性を保持していることを見出した。従来の報告からは精製過程におけるPdc活性の失活は酵素の不安定性によるものと考えられたが、検討の結果から精製過程の失活はPdcの不安定性に起因するものではなく、補因子の遊離によるものと考えることができる。そこで遺伝子工学的手法を用いて精製Pdc、精製Kpdを調製し、これらが結合している補因子を明らかにすることを通してPdc反応のメカニズムを明らかにする。
(2)高活性化Pdcを発現しccMAを蓄積するP. putida組換え体の作出とccMA生産能力評価
26年度に作出したPAとccMAを代謝できない変異株を宿主として、高活性化Pdcを発現する組換え体を作出し、リグニン系芳香族化合物を原料としたccMA生産能力を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
生じた次年度使用額は、共同研究のため米国に長期渡航したため、当初予定していた物品の購入を見送ったものである。この渡航による研究計画への影響はわずかであり、ほぼ順調に研究計画は進行している。
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| 次年度使用額の使用計画 |
未使用分の助成金は当該年度の助成金と合わせて、遅れている部分の研究計画を加速するための物品費（試薬；遺伝子操作用、酵素機能評価用）および学内共同利用施設利用料に使用する。
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