| 研究課題/領域番号 |
26850053
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉田 昭介 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究員 (80610766)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ポリエチレンテレフタレート / モノヒドロキシエチルテレフタレート / ゲノム / PETase / MHETase |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ポリエチレンテレフタレート分解菌より同定した二種の新規酵素PETase, MHETaseの機能同定、機能改良を目的としたものである。本年度は①PETaseの結晶化に向けた可溶性タンパク質の大量調整法の確立、②PETaseへの部位特異的変異導入による活性向上と安定性向上、③界面活性剤添加によるPETase活性の向上、について種々の検討を行った。①では、尿素を用いたケミカルリフォールディングが可溶化に有効であることがわかった。しかし、可溶化率が低かったため、リフォールディングにおいて種々の小分子を加えて可溶性の向上を試みたところ、塩化カルシウムとアルギニンが有効であることがわかった。②では、PETaseホモログのうち耐熱性タンパクとのアライメントから、PETaseにおいては保存されていないアミノ酸残基に着目して変異導入を行った。またPETaseのホモロジーモデルを作製し、表面の疎水性アミノ酸に着目して変異導入を行った。その結果、活性部位周辺のトリプトファンW132をヒスチジンに置換したW132H変異体はPET分解活性が野生型と比べ1/4程度に低下したものの、耐熱性が向上していることが分かった。③では、アニオン性の界面活性剤の添加が、PETaseのPETへの吸着を促進し、PET加水分解性を数倍向上させることがわかった。PET分解菌とその分解メカニズムについて纏めた論文をScience誌に投稿し、受理された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PETaseの機能について多くの生化学的知見を得ることができた。PETaseの大量調整法についても目処がついたので、結晶化スクリーニングを本格的に始める準備が整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
PETaseの結晶化スクリーニングを進める。また、MHETaseについても可溶性タンパク質の大量調整法を確立し、結晶化スクリーニングを開始する。PETaseの機能向上、耐熱性向上について、遺伝子のランダム変異による変異ライブラリーの作製と、ハイスループットなスクリーニング系を構築し、優良な変異体を選別する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Science誌への投稿論文の準備等に時間を割かれたため、一部実験を次年度に移行することとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
移行させた実験について、速やかに実行に移す予定である。
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