| 研究課題/領域番号 |
26850055
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
梶川 揚申 東京農業大学, 応用生物科学部, 助教 (30646972)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 乳酸菌 / 走化性 / べん毛 |
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| 研究実績の概要 |
Lactobacillus agilis変異株および組換え体作製：後述するフラジェリンの特性解析の結果より，L. agilisが持つフラジェリンの免疫系へのインパクトは大きくないことが予想された．そこで当初の予定を変更し，走化性のシグナル伝達に関わるcheA遺伝子を変異させることにした．蛍光タンパク質発現株の作製については，mTFP1またはtdTomatoのいずれかを発現する組換え体を作製した．蛍光は検出されたものの，安定性の問題を解決する必要があった．
培養細胞を用いた運動性の評価：当初予定されていたHT-29細胞では均質な粘液層を安定的に形成させることが困難であり，実験は難航した．代替実験として，ムチンと寒天を混合した擬似的な粘液層を用いて，L. agilisが粘液層を通過することを実証した．
走化性因子の探索：動物腸管内に存在すると考えられる物質への走化性を，ガラスキャピラリーを用いたアッセイにより定量的に評価した．結果として，酸や胆汁からの忌避，グルコースやN-アセチルグルコサミンなどの糖類への集積が認められた．
マウスを用いた定着性試験：motB変異により運動性を失った有べん毛L. agilis変異株にストレプトマイシンおよびリファンピシン耐性を付与し，抗生物質を経口摂取させたマウスへ定着させた．経時的な糞便中の菌数と，エンドポイントにおける腸管内の菌数を計測した．抗生物質共存下において安定的な定着がみられたものの，野生株と変異株の間において明確な菌数の差異は認められなかった．
フラジェリンの特性解析：L. agilisのべん毛繊維は酸や温度上昇に対して比較的安定であった．また，Caco-2細胞の刺激によるインターロイキン-8産生誘導試験により，L. agilisのフラジェリンはToll-likeレセプター5による認識が弱いことが明らかとなった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画から変更された部分や難航している実験もあるが，それらを補う新しい知見があるため，全体的には順調に進展している．具体的には、変異体作製やin vitroでの評価はやや遅れているものの，次年度の予定であったマウスを用いた定着性試験の結果の一部が既に得られていること，当初の計画には無かったフラジェリンの特性について新知見が得られたことが挙げられる．特にべん毛の特性に関する新知見については論文も発表できたことから大きな成果であったといえる．さらに，フラジェリンの免疫学的特性についてさらなる展開が期待できることから，追加の実験が進行中である．一方，マウスを用いた定着性試験の結果が予想とは異なっていたことから，仮説の再検討や，マウスまたは近縁動物由来の運動性Lactobacillus属細菌の分離を継続する必要がある．
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画と変更・追加された項目について実験を進める．また，研究成果の発表準備も併せて行う．
変異株作製と評価：cheA遺伝子変異により運動性を示すが走化性を失った変異株の取得を目指す．この変異株と野生株との比較により，走化性が腸内定着に関わる可能性を評価する．
フラジェリンへの変異導入：L. agilisが持つフラジェリンはTLR5を介した炎症誘導能が低いことが示された．その原因としてTLR5認識部位のコンセンサス配列における変異によるものである可能性が考えられた．そこで，当該部位のアミノ酸配列を変換することで，炎症応答への影響を調べる．
げっ歯類由来運動性Lactobacillusの分離：腸管内共生微生物には宿主特異性があると考えられている．そこで，より自然に近い宿主-微生物モデルの確立に向け，げっ歯類の糞便中より運動性Lactobacillus属細菌の分離を試みる．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度末，オープンアクセスジャーナルへ投稿した論文がアクセプトされており，為替レートの変動を加味した掲載費用を，余裕を持って確保しておく必要があった．
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| 次年度使用額の使用計画 |
掲載費用の決済が完了したうえで，余剰金は次年度の消耗品購入費用として有効に使用する．
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