| 研究課題/領域番号 |
26850057
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| 研究機関 | 大阪歯科大学 |
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研究代表者 |
円山 由郷 大阪歯科大学, 歯学部, 助教 (90610296)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | アーキア / 染色体 |
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| 研究実績の概要 |
超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisは、染色体を構成する主要なタンパク質として、histone、TrmBL2、Albaを持つことが知られている。これまでに、転写因子様タンパク質TrmBL2は、染色体上に多量に存在することや、ゲノムDNAを覆って染色体上に線維状の構造をつくること、多くの遺伝子の転写を抑制していることが知られていたが、その生理的な意義は未だに十分に解明されていない。2014年度は、TrmBL2の機能解明にむけて、以下の研究を行った。
（１）磁気ピンセット等の一分子計測技術を用いてTrmBL2の機能を解析した。その結果、TrmBL2が結合するとDNAの剛性が増すこと、またDNAをねじる力にたいして、コイルの形成が起こりにくくなる一方、二本鎖の開裂が起こりやすくなることを示した。さらに、hitoneとTrmBL2が競合してDNAに結合すること、およびカリウムイオン濃度によってこの２つのタンパク質のDNA結合のバランスが変化しうることを示した。これらの結果は、細胞内の環境変化によって、histoneとTrmBL2が染色体の構造や機能を動的に制御していることを示唆する。
（２）TrmBL2と相互作用するタンパク質を明らかにするために、TrmBL2複合体の免疫沈降の条件検討を行った。準備が整い次第、2015年度にはTrmBL2と相互作用するタンパク質の同定を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
磁気ピンセット等の一分子計測によって、TrmBL2がDNAに結合すると、DNAの剛性が増し、DNAをねじる力にたいして、コイルの形成が起こりにくくなる一方、二本鎖の開裂が起こりやすくなることを示した。また、hitoneとTrmBL2は競合してDNAに結合するが、細胞内のカリウムイオン濃度によって、結合のバランスが変化する可能性を示した。これらの結果は当初予定していなかったものであり、TrmBL2の機能解明に向けて予想以上に研究が進んだ部分である。この結果は、近く論文として公表する予定である。
また、TrmBL2の機能解明に向けて、TrmBL2破壊株における様々なDNA損傷ストレスに対する感受性試験に着手している。2015年度には、この結果を発表する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2015年度には、主に(1)転写因子様タンパク質TrmBL2のさらなる機能解析と、(2)DNA結合タンパク質Albaの機能に関する研究を進める。
(1) TrmBL2の機能解明について、免疫沈降によりTrmBL2に結合するタンパク質を同定する。また、Thermococcus kodakarensisの野生型とTrmBL2遺伝子破壊株のプロテーム解析やメタボローム解析を行う。これらの結果から、TrmBL2の機能を絞り込むことができると期待される。さらに、様々なDNA損傷に対して野生株とTrmBL2破壊株の感受性を比較することで、TrmBL2が超好熱性アーキアのゲノム安定性にどのように寄与するのかを明らかにできる。
(2) Albaは、すべての超好熱菌が共通してもつDNA・RNA結合タンパク質である。Albaがどのように染色体の機能を制御しているかについては不明な点が多い。Albaはアセチル化を受けることでDNAへの結合力が変化することが知られているが、他の翻訳後修飾をうけている可能性もあることから、今後、免疫沈降や質量分析をもちいて、どのような修飾を受けているかを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2014年度は、一分子計測によるTrmBL2の機能解析が予想以上に進展したために、当初の計画を変更してこの解析に集中した。また、当初の計画では2014年度にTrmBL2の免疫沈降実験・メタボローム解析実験を計画していたが、条件検討に想定以上の時間がかかり、2014年度中には予定していた質量分析・メタボローム解析が行えなかったため。また、同様の理由により、2014年度に予定していたAlbaの機能解析実験の一部も2015年度に実施することとなったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
2015年度は、TrmBL2の免疫沈降、および結合タンパク質の質量分析・メタボローム解析に向けて条件検討を早急に進め、解析を行う。助成金の一部は、解析を外部業者に委託するため費用として用いる。その他、DNA損傷に対する感受性試験を行うためのプラスミド構築等にかかる費用として、助成金をあてる。
また、Albaの機能解析のための免疫沈降・質量分析、抗体作製費用に助成金をあてる。
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