| 研究課題/領域番号 |
26850189
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
竹前 喜洋 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門越境性感染症研究領域, 主任研究員 (10584386)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | インフルエンザ / 鳥 / 豚 / 温度感受性 / 宿主特異性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、鳥と豚の宿主体温の違いに着目し、鳥由来A型インフルエンザウイルス（AIV）が豚で長期間維持されるために必要なウイルス側の要因を明らかにすることを目的としている。これまでに、豚肺胞上皮細胞で低温条件で継代を繰り返すことにより、低温で高い増殖をもつA/teal/Tottori/150/2002(H5N3) （鳥取株）とA/whistling swan/Shimane/580/2002(H5N3) （島根株）の二つのAIVを得た。昨年度までに、鳥取株の低温順化に伴う塩基置換の解析と鳥取株の野生型遺伝子及び低温馴化に伴う塩基置換を導入したpHW2000を作製し、ウイルス作製を試みた。
平成27年度においては、昨年度に引き続き、リバースジェネティクス法による鳥取株の野生型及び変異導入型ウイルス作製を試みた。しかしながら、Transfection及びTransfection後のウイルスレスキューの条件検討を行ったが、いずれの方法においても鳥取株を作製することができなかった。そのため、もう一方の低温順化株である島根株を用いて以下の実験を行った。島根株の野生型、低温条件で6代継代後ウイルス、14代継代後ウイルスの全ゲノムを次世代シーケンサーを用いて比較した結果、低温順化に伴って、PB2遺伝子に1箇所、PB1及びHA遺伝子に2箇所ずつ、NA遺伝子に4箇所の塩基置換が蓄積していくことが確認された。島根株の野生型遺伝子（8本）及び低温順化株に認められたPB2、PB1、NA、HA遺伝子に各塩基置換を導入したpHW2000プラスミドを作製した。野生型島根株及びリボヌクレオプロテイン複合体を形成するPB2、PB1に認められた塩基置換を導入したウイルスを作製し、MDCI細胞における温度感受性試験を実施した。その結果、PB2とPB1遺伝子に認められた塩基置換がウイルスの低温増殖能に関与している可能性を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究実施計画では、野生型及び変異導入した鳥取株を作製し、低温順化に関連する遺伝子同定を目標としていた。しかしながら、野生型及び変異導入した鳥取株をレスキューすることができなかったために、当初の実験計画通りの進行が困難となった。そのため、年度途中よりもう一方の低温順化株である島根株をターゲットとする実験方針に切り替えた。島根株においては、低温順化に伴う塩基置換の解析と野生型及びポリメラーゼ遺伝子変異型ウイルスの作製が終了したため、今後は実施計画に基づいた温度感受性試験やポリメラーゼ活性測定を実施することが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
鳥取株が作製できなかったため、今後は島根株を用いて以降の実験を行う。この方針転換により、野生型及びポリメラーゼ遺伝子（PB2, PB1）に低温順化に伴う塩基置換が導入されたウイルスの作製が可能となった。さらに、MDCK細胞を用いた温度感受性試験によりポリメラーゼ遺伝子の塩基置換が低温感受性に影響を与えている可能性が得られたため、今後は、研究実施計画に基づいてそれらの塩基置換がウイルスポリメラーゼ活性に与える影響を調べる。また、ポリメラーゼ遺伝子以外で低温順化型島根株に認められたHA及びNAにおける塩基置換についてもMDCK細胞や豚肺胞上皮細胞を用いた温度感受性試験により低温増殖能獲得に関与しているかを調べる。
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