| 研究課題/領域番号 |
26850220
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| 研究機関 | 独立行政法人農業生物資源研究所 |
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研究代表者 |
二橋 美瑞子(長内美瑞子) 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (00422402)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 昆虫 / 色素 / オモクローム / カイコ |
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| 研究実績の概要 |
オモクローム色素は、様々な昆虫の赤、茶、紫などの体色を担う昆虫の主要な色素である。これまで生化学やショウジョウバエの遺伝学の研究が中心であったが、特に色素合成の後半部分に関する分子機構はほとんど未解明なままであった。本研究では関連すると予想されるカイコの卵色変異体の解析を通じてこのブラックボックスにアプローチする。
カイコの卵色の劣性変異体pe (pink eyed white egg, 淡赤眼白卵)については、原因遺伝子の解明のため、野生型系統で卵が着色する時期で、野生型とpeとについて次世代シークエンサー解析（RNAseq）を行った。その結果、連鎖解析により絞り込まれていた責任領域の中に、pe特異的な変異を持つ遺伝子が得られた。この遺伝子を、embryonic RNAiとTALENによるノックアウトにより機能解析を行った結果、peと同様の卵色・眼色の表現型が得られた。成虫複眼における組織特異的RNAiでも、pe変異体の複眼色が再現された。さらに、遺伝学的解析や、幼虫皮膚部位特異的RNAi でも、pe変異体もしくは候補遺伝子の抑制で幼虫の赤い斑紋の色が生じないこと明らかにした。最終的には、候補遺伝子ノックアウト個体と既存のpe変異体との相補性試験により、peの原因遺伝子であることを証明できた。さらに、甲虫コクヌストモドキにおいてpe遺伝子のホモログを、RNAiにより抑制するとpe同様赤い複眼を呈することも判明した。この結果は第37回日本分子生物学会年会で発表し、現在、論文投稿中である。
3種の褐卵変異系統について、野生型で着色する時期に対応する卵と、卵巣から、RNAseqライブラリを作製した。また、連鎖解析を行うため、変異体と野生型を交配と、F1と変異体との戻し交配により、BF1個体を得た。卵色が母性遺伝する変異体もあるため、BF1個体は成虫まで飼育し、交配してメスが産んだ卵の色から判定、記録し保存した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
pe変異体については、平成27年度に行う予定であったコクヌストモドキのRNAi解析を前倒しで行った。さらに、予定にはなかった、成虫複眼・幼虫ヒフの局所的RNAi解析を行い、論文投稿も行った。褐卵変異体b-4については、BF1の孵化率が悪かったため、個体数確保のため3か月かかる飼育・交配のやり直しを行い、さらに文献情報よりも、BF1当代の卵色判定が難しかったため、当初の予定になかったBF1の飼育と交配を行った。b-tとb-2に関しては、予定を前倒しでBF1個体を得るための交配を行った。全体としては計画以上に研究が進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度末に投稿したpe変異体の論文の受理を最優先に実験を行う。
3種の褐卵変異体b-2, b-4, b-tについては、BF1個体からDNA抽出を行い、RAD-seqライブラリーを作製し、RNA-seqライブラリと合わせて次世代シークエンス解析を行う。データ解析を行い、それぞれの変異体についてRAD-seqからは交配に利用した野生型と変異体で異なる配列（ＤＮＡマーカー）を単離し、BF1においてＤＮＡマーカーと表現型の比較から連鎖するゲノム領域を調べる。RNAseqのデータの解析では、連鎖するゲノム領域内に存在し、卵着色時期に発現していてかつ褐卵変異体特異的な変異や異常な発現パターンを持つ遺伝子の探索を行うことにより、変異の原因遺伝子の候補を得る。候補遺伝子が得られたら順次遺伝子機能解析を行い、変異体の原因遺伝子であるか調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RAD-seqライブラリについて余剰の試薬を使わせていただけるめどがついたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成26年度まで農業生物資源研究所で日本学術振興会特別研究員PDであったが、平成27年度4月1日から茨城大学理学部に准教授として赴任した。
本課題を続けるためには、基本的な設備をほぼ一から買いそろえなければいけならず、冷凍庫等を次年度使用額を利用して冷凍庫などを購入予定である。
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