| 研究課題/領域番号 |
26850230
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
早川 晃司 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (50636800)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | リンカーヒストン / 核小体 / エピジェネティクス / クロマチン |
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| 研究実績の概要 |
本年度ではクロマチン免疫沈降―シークエンス法 (ChIP-seq法)によってH1Tのゲノム標的領域を同定し、rDNAリピート上での機能を明らかとした。
昨年度までに取得していた胃癌細胞株AGS細胞および乳癌細胞株MDA-MB231細胞に加え、H1Tが発現していることが明らかとなったマウス胚性幹細胞(ES細胞)においてH1T抗体を用いたChIP-seq法により、H1Tのゲノム標的領域を探索した。その結果、H1Tは遺伝子領域よりもリピート配列によく結合していることが分かった。そこで、リピート配列のデータベースであるRepbase(http://www.girinst.org/repbase/)と照合させたところ特にrRNAをコードしている領域に多く結合していた。これまで報告されている他のH1バリアントのChIP-seqデータと比較解析を行ったがこれはH1Tに特徴的な結果であった。rRNAをコードしているゲノム領域はrDNAと呼ばれrRNAコード領域と非コード領域が数百コピー連続してゲノム上に存在し核小体内に収納されていることが知られている。そこで、rDNA上での局在をより詳細にChIP-qPCR法によって調べところ、癌細胞およびES細胞のいずれの細胞種においても、非コード領域よりもrRNAコード領域により多く結合していた。
次に、H1TのrDNAリピート上での機能を明らかにするため、前年度までに作成していたH1T強制発現細胞(AGSとMDA-MB-231の2種類)を用い、DNaseI感受性法およびMNase感受性法によってH1Tのクロマチン構造に対する役割を調べた。その結果、H1Tの強制発現によってrDNA上の特にrRNAコード領域のクロマチンの凝集が起こっていた。
前年度までの成果と合わせると、H1Tは核小体に局在し、その中でrDNAリピートに結合することでクロマチンの凝集を促し、rRNAの転写を調節する機能を有することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究課題名にも挙げたH1Tの核小体内での機能を本年度までに概ね明らかとし、これまでの成果を学術論文としてまとめ、受理されるまで達成することができた。
ただし年度当初に計画していたH1TのChIP-seqデータから、「rDNA vs. 遺伝子領域」の比較を行い、ゲノム領域によってH1Tに機能差異があるかを明らかにすることができなかった。そのため、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の後半は学術論文の作製を重点的に行ったため、当初計画していたChIP-seqデータを利用してrDNAリピート上と遺伝子領域上の機能差異を明らかにするまで至ることができなかった。本年度の成果から分かっていることとして、H1Tは割合としてリピート領域に多く結合していたものの、ユニーク領域(遺伝子領域)にも結合していた。そこで、今後の推進方策の中心は、遺伝子領域上でのH1Tの機能を明らかにし、rDNA上での役割と比較解析していく。加えて、H1Tの核小体における共役因子(ヒストンシャペロンなど)と核小体以外の核質での共役因子を免疫沈降法によって明らかにする。これまでに、核小体タンパク質と核質タンパク質を分離する手法は確立できているため、それぞれの分画を用いH1T抗体によって共免疫沈降を行う。これまでの報告からヒストンシャペロンとして考え得る因子やH1TのChIP-seqデータを利用しモチーフ解析を行うことで候補を絞っていく。それによって、H1Tの核小体および核質での機能発揮に必須の要因を突き止める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度後半より学術論文の作製を行い、投稿に至った。平成28年3月に学術専門雑誌に論文が受理され論文投稿料としての使用を予定していたが、支払い手続きが3月末までに完了しなかったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度の繰越は論文投稿料としての使用を主としており、投稿料の支払いは4月中に完了することが予定されている。論文投稿料として使用した後の繰越の残額は、昨年度当初の計画通り、実験消耗品の購入に使用する。
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