| 研究課題/領域番号 |
26850232
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
長野 稔 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (80598251)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 膜ラフト / 自然免疫 / イネ |
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| 研究実績の概要 |
本研究はイネの自然免疫機構における膜ラフトの機能を解明することを目的とし、1. 病害応答性膜ラフト局在型OsRbohの同定と機能解析と、2. 新規の病害応答性膜ラフトタンパク質の同定と機能解析、の2つの解析を行っている。
本年度は1に関してはまず、イネに存在する9つのRboh（OsRbohA-OsRbohI）の詳細な組織別発現解析を行った。その結果、前年度の解析から病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであると同定されたOsRbohHはイネ培養細胞での発現が高いにもかかわらず、植物体での発現は極めて低かった。一方、同じく病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるOsRbohBは、OsRbohHとは逆に培養細胞での発現が低く、植物体での発現は高かった。そこで、RNAi法を用いてOsRbohBをノックダウンさせたイネ植物体（OsRbohB-KD）を作出し、イネいもち病菌接種実験を行った。その結果、野生型と比較してOsRbohB-KDでは病班長の拡大、及び菌量の増加が見られたため、OsRbohBがイネいもち病耐性に必須であることが見出された。この結果から、病害応答性膜ラフト局在型OsRbohのイネ免疫機構における重要性が明らかになった。
2に関しては、前年度同定した新規の病害応答性膜ラフトタンパク質の中からOsRbohB&HやOsRac1と同様にキチン処理後10分で増加し、30分で元に戻る一過性膜ラフトタンパク質に着目し、4つのタンパク質に関して蛍光タンパク質融合タンパク質を作製し、共焦点レーザー顕微鏡で局在観察を行った。その結果、いずれも細胞膜に局在し、膜ラフトへの局在性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
病害応答性膜ラフト局在型OsRbohであるOsRbohBがイネ自然免疫に必須であることを新しく見出すことができた。また、この結果を論文にまとめて投稿することができた。また、新規の病害応答性膜ラフトタンパク質候補の中で膜ラフトへの局在が示唆されるタンパク質を選抜できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1に関しては、本年度においてGFP-OsRbohBとmCherry-OsRac1との細胞膜上での詳細な共局在を全反射照明蛍光顕微鏡を用いて観察しようと試みたが、プロトプラストでの一過的発現系を用いたためか共発現している細胞の数が少なく、顕微鏡観察を行うことが困難であった。そこで、恒常的にGFP-OsRbohBとmCherry-OsRac1を共発現させたイネ培養細胞を作出し、細胞膜上での詳細な共局在性の観察に再度挑戦する。
2に関しても、これまで細胞膜に局在することが明らかになったタンパク質に関して、その蛍光タンパク質融合タンパク質を恒常的に発現するイネ培養細胞を作出し、全反射照明蛍光顕微鏡を用いて細胞膜上での詳細な局在解析を行う。
上記の解析には、イネに病害応答反応を引き起こすキチンを用いることで、その応答性に関しても解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度試みた全反射照明蛍光顕微鏡を用いたGFP-OsRbohBとmCherry-OsRac1との細胞膜上での詳細な共局在観察が、プロトプラストでの一過的発現系を用いたことが原因で、鮮明な画像を得ることができなかった。そこで、次年度では恒常的にGFP-OsRbohBとmCherry-OsRac1を共発現させたイネ培養細胞を作出し、細胞膜上での詳細な共局在性の観察に再度挑戦する。
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| 次年度使用額の使用計画 |
新たなコンストラクトの作製と、それを形質転換したイネの作出をためのキット類、及び培地作製等の試薬類を購入する。また、全反射照明蛍光顕微鏡は他研究機関のものを使用させていただくため、そのための出張費として使用する。
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